分子生物学在食品微生物检测中的应用

2013-08-15张秋楠

生物技术世界 2013年1期

张秋楠

(大庆日月星有限公司黑龙江大庆 163319)

2011年地沟油流向百姓餐桌,塑化剂大规模污染食品药品,双汇曝出瘦肉精事件,染色馒头,富含亚硝酸盐的血燕,蒙牛牛奶黄曲霉素超标,速冻食品中金黄色葡萄球菌检出,让人们越来越重视食品安全问题,微生物对食品的污染问题也相应的备受关注。食品安全是在设计品生产、加工、储存、运输、销售等各个环节中确保食品卫生和使用安全,降低疾病隐患,防范食物中毒的一个跨学科领域。在每个环节都有污染微生物的可能,微生物的污染会造成食品腐败变质,或导致食源性感染和食物中毒。为了防止此类事件的发生,采用适当的检验方法检验食品中的微生物就显得十分必要,本文综述了分子生物学在食品微生物检测中的应用

1 PCR扩增法

PCR法是分子生物学研究中最常用的技术,从基因的扩增,到基因的检测,每个分子生物学实验室PCR仪是个必备工具。PCR技术利用设计出来的引物可以针对不同的基因,甚至通过设计简并引物,我们可以将一类含有保守区段的基因扩增出来。在食品微生物的检测中,我们可以应用细菌的各种菌种的保守序列设计特异性引物,对我们从食品中提取出来的DNA样品进行扩增,通过琼脂糖凝胶电泳分离条带进行比对检测。蔡亦红等建立了肠毒性大肠埃希菌、伤寒沙门菌、福氏志贺菌三种致病菌的多重PCR技术,通过对3种食源性致病菌的特异性基因片段的选择,建立多重PCR体系并优化。Kim等运用多重PCR技术完成对大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌等的检测。普通的PCR只能定性的检测是否含有某些细菌基因的保守区段,目前通过对PCR方法的改进,或者扩增条件的改变,已经将PCR法应用于定量的检测。其中包括免疫捕获PCR,荧光定量PCR等。

1.1 免疫捕获PCR

免疫捕获PCR是先通过免疫动物从动物的血清中获得特异性抗体,然后通过ELISA法测定抗体的效价,再将抗体固定在磁珠或者是管壁上,然后加入过夜培养的菌液,在食品微生物的检测中,要用从食品中提取的菌液进行孵育,最后加入PCR反应试剂,进行PCR扩增,对扩增的结果利用琼脂糖凝胶进行电泳,从电泳个图谱中分析是否含有某种微生物。这个方法速度比较快而且准确。

1.2 荧光定量PCR 法

荧光定量PCR是在1996年由美国公司发明的技术,这项技术可以将原来的PCR的定性实验,发展为定量实验。它就是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的鸡肋检测PCR的进程,最后利用曲线来对未知的摸板进行定量分析的方法。目前,这项技术已经应用于很多食品中微生物的检测,对食品中的阪崎肠杆菌,沙门氏菌,志贺菌,单增李斯特菌,金黄色葡萄球菌,乳酸菌等的检测过程中都表现出了良好的可信度。

2 DNA指纹图谱技术

2.1 DGGE

DGGE(变性凝胶梯度电泳)是在聚丙烯酰胺凝胶中加入变性剂(尿素和甲酰胺),在电泳时双链DNA分子会因为所含碱基对不同,导致解链的温度有差异,导致DNA分子在凝胶中的存在位置不同,形成不同的条带,只要把电泳的条件改变的足够精细,哪怕是只有一个碱基差异的DNA分子也可以分开。在食品微生物的鉴定中,我们可以先从食品中提取DNA或RNA然后进行PCR或RT-PCR的扩增,然后利用DGGE凝胶电泳最后进行谱带分析,对条带进行测序后进行系统发育分析最后分离富集。2004年J.Theunissen和TJ.Britz等人用DGGE法对南非益生茵食品进行了抽样检查,确认了食品中的微生物。Milica Nikolic等人通过PCR—DGGE的方法鉴定了山羊奶干酪中的乳酸杆菌。

2.2 RAPD 技术

RAPD是利用随机引物,进行PCR反应扩增DNA,扩增出的DNA片段的大小和数量呈现多态性。这种方法有很高的敏感性和特异性,不同的微生物细胞中DNA不同,扩增出的片段也各不相同,最后我们可以对扩增产物进行分析,了解食品中的微生物的种类。G.Spano等利用RAPD技术将从红葡萄酒中分离出的一个菌株确定为植物乳杆菌;Walczak等利用RAPD技术鉴定出非生产用酵母菌株与标准清酒假丝酵母菌株具有遗传相似性。此外这项技术还可以应用于金黄色萄球菌、大肠埃希氏、沙门氏菌和志贺氏菌。

2.3 AFLP

AFLP(扩增片段长度多态性分析技术)是利用限制性核酸内切酶对基因组进行酶切,不同的基因组酶切片段不同,然后对这些DNA片段进行扩增,扩增得到的片段各不相同,利用琼脂糖凝胶电泳或者聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析,会呈现片段的多态性。李海星等人运用AFLP技术对发酵酸面团中乳酸菌多态性进行了研究。NairS等人利用AFLP对伤寒沙门菌进行了分型。Aarts等在对62个血清型的78株沙门氏菌株进行AFLP指纹分析发现所有的血清型都具有独特AFLP指纹图。Velappan等将单酶切AFLP技术(SE2AFLP)用于对Bacilli 亚群1,Yersinia,Staphylococcus和Escherichia coli菌种和菌株的鉴定。