DNA条形码技术在常见水生动物分类中的应用

吴清楠

(暨南大学 广东广州 510632)

DNA条形码是指生物体内一段具有足够变异的标准化短DNA片段,这段保守的DNA片段在不同物种之间具有特异性,能够很好地代表不同物种,因此在分类学和鉴定学方面起着重要的作用。DNA条形码技术是使用DNA条形码来进行快速的物种鉴别和分类的一种技术,普遍方法是对待测物种680bp长的线粒体细胞色素C氧化酶亚单位Ⅰ(Cytochrome C oxidase subunit,COⅠ)基因进行测序,采用Kimura-2-Parameter模型分析物种之间的遗传距离构建系统发育树,并与DNA条形码数据库中该物种及其近似种序列进行对比,根据相互间的遗传距离或相似度最终对检测物种进行鉴定[1]。

自从DNA条形码技术的概念被提出并随即推出“生命条形码”项目后,这项简单而实用的技术引起了分类学家、生态学家、生物学家、农学家、植物学家等的高度重视[2],人们采用DNA条形码技术发现了更多的新物种和隐存种、提高了物种分类的分辨率,同时也指出并纠正了以往分类中所存在的错误,运用新生的DNA条码技术再结合传统的分类学审查能够揭示更加丰富的生物多样性,为研究生物进化过程提供了新的思路[3]。

1 DNA条形码在鱼类方面的应用

鱼类在水生生态系统扮演着一个很重要的角色,然而对鱼类进行准确辨别存在一定的难度,特别是在生物多样性很高的热带地区,仅仅光靠外部形态特征很难区分鱼的具体品种。为了解决这个难题,Nwani等[4]将来自尼日利亚东南部的363个鱼类样本的DNA提取出来,PCR扩增后对标准条形码序列进行测序,由于生物条形码数据系统中包含了几乎所有物种的标本数据以及相关序列信息,最后通过系统所提供的分析工具估算出种间的平均遗传距离差异60倍高于种内的平均遗传距离,种内样本平均遗传距离差异是0.17%而同间则达到10.29%,很好的区分了那些表面看上去很相似但是遗传距离却相差60倍的鱼类。在亚洲地区,Zhang等人[5]研究了158种来自日本海洋的229个鱼类COⅠ基因样本,实验结果也表明种间的平均遗传距离将近60倍高于种内的平均遗传距离,并且两个物种的杂交现象也可以通过在寿命数据系统(BOLD)里搜索条码来检测,说明了DNA条形码技术的确提供了一种新的鱼类鉴定方法。Wang等人[6]计算出来自中国南海重要渔区的样本同系平均遗传距离差异为17.260%,同属之间为20.097%,而同种内个体之间只有0.317%,但他特别指出条形码技术识别的确具有一定的可靠性和可用性,但由于一些密切近源种可能会有渐渗杂交,因此为了得到更加精确的分类结果,即使运用了条形码技术也还需要进行分类学上的审查。此外DNA条形码技术为人们提供了更加高效的工具来研究那些仍旧不为人知的隐性种,Zemlak等[7]研究了印度洋沿岸35种鱼的229个COⅠ基因样本,发现南非和澳大利亚海域的同种鱼类的差异很大,说明了有大量的隐存鱼种存在。

在市场方面,鱼类是人类食物主要的蛋白质来源之一,因此鱼类市场的发展日益迅猛,然而在全球市场中鱼类贴错标签现象成为一个越来越严重的问题。在南非,Cawthorn等[8]测定了南非海鲜批发商和零售店的248种鱼类的COⅠ基因序列,95%的样本都可以被准确鉴别,但反映出来自批发商的9%样本以及来自零售商的31%样本标签上写明的种与其真正属于的种并不一致。同年在美国华盛顿州,Cline等[9]对整个华盛顿州西部的商店和餐馆的鲑鱼也进行COⅠ基因测序,数据表明在99个样本中有11%是把大西洋鲑鱼当做太平洋鲑鱼来卖,超过38%的餐馆会混淆鱼的品种。鱼类品种混淆的原因有一部分是无意识或者了解程度不够的失误,但不可否认的是也有一部分是贩卖商为了增加利润而刻意用价格低廉的相似海鲜种类代替昂贵或者需求高的种类,损害了消费者的利益破坏市场的贸易平衡,因此DNA条形码技术推广使用可以大大提高国内外鱼类等海鲜市场的交易透明度,促进市场经济的正常发展。

2 DNA条形码在软体动物方面的应用

鞘亚纲(Coleoidea)是头足纲(Cephalopoda)下的一类软体动物,在海洋生态系统占据重要位置也具有很高的商业价值,但是一些鞘亚纲物种很难根据传统的形态特点来进行区分,不仅是由于关系密切的种群之间的形态差异很细微,还要考虑到在标本捕捉的过程中可能会损坏某些特征形态增加了鉴别的难度。Dai等认为DNA条形型码技术在识别鞘亚纲方面有着很大的潜力,他们使用了两个线粒体片段COI基因以及核糖体大亚基16SrRNA,对种内和种间的遗传距离进行了评估,并用邻接树(Neighbour-joining tree)和贝叶斯树分析(Bayesian analyses)鉴定了了来自中国大约三分之一的34种鞘亚纲样本之间的关系,这项研究不仅发现了神秘的鞘亚纲的多样性,而且还新颖的使用了两个线粒体基因来研究进化关系为其他生物学研究奠定了新的基础[10]。同属于头足纲的蛸科(Octop odidae)中物种间亲缘关系现今仍然了解得很贫乏,DNA条形码技术推出后,Kaneko[11]使用COI和COIII的基因序列调查了日本邻近海域的浅水章鱼间的亲缘关系,并与借助形态学分类得出的鉴定结果进行比较。实验结果所获得的来自7个属34个种的45个样本的COⅠ(657bp)和COⅢ(464bp)序列作为参照样本被保存在东京国家自然科学博物馆,这一结果这为将来的章鱼鉴定提供了一个初步的参考数据库。同样,Sun[12]等人的研究中收集了来自中国沿海的45种新进腹足超目(Caenogastropoda)的110份COⅠ基因样品,在研究中邻接树和贝叶斯树的数据为DNA条形码技术准确区分物种提供了有效的证据。

软体动物中还有经常见到的双壳纲(Bivalvia),为了对扇贝科(Pectinidae)有进一步的了解,Feng等[13]测定了8种63例扇贝的线粒体COⅠ基因和16SrRNA基因的部分序列,表明DNA条形码技术同样可以分析出种间的遗传差异水平远远大于同一种内的遗传差异水平从而对这些扇贝进行分类,并且识别的结果和以壳微观结构和形态特征为主的沃勒分类结果一致。马蛤蜊科(Mactridae)的物种由于身体柔软而具有很高的可塑性,因此在形态上难以区分,Ni等[14]认为DNA条形码技术可以为这个难题提供有效的解决措施,实验中对36个样本的COⅠ基因和16SrRNA基因的部分序列进行测序,结果表明在COI基因中有着明显的遗传差异,但是在16SrRNA却没有。尽管如此但邻接树和贝叶斯树仍旧指出的除了一个样本以外其他所有样本都属于同一物种下的单系分支,同时序列变异现象和贝叶斯的拓扑结构也揭示着潜在隐性种的存在。

3 DNA条形码在甲壳类动物方面的应用

海洋甲壳类动物由于高度的形态多样性通常都很难利用传统方法进行识别,不少研究尝试运用DNA条形码技术去探索甲壳类物种之间的分界线。为了扩充DNA条形码数据库,Radulovici等[15]研究来自圣劳伦斯湾河口的软甲纲样本,在95%的情况下样本检测出的基因序列与已知的一致,还发现了四个物种的种内差异高达3.78%～13.6%,这说明了存在隐存种,实验证明了DNA条形码技术对许多后生动物群体包括甲壳类动物的鉴定十分有效。长臂虾科种内和种间形态变异很保守,而Robe等[16]运用条形码技术去识别长臂虾科的种内和种间的差异,尽管只能够区分95%的情况,但是和以往落后的分类学技术相比,条形码技术很有可能帮助人类发现以前所忽略的分类和进化问题。

在智利,甲壳类动物如短尾蟹是一项利用极其广泛的海洋资源,在大量投入蟹肉制品生产的过程中就出现了难以鉴定蟹品种的技术问题,这成为阻碍蟹肉制品产业发展的一大障碍。在Haye等[17]的研究中尝试将DNA条形码技术投入商业之中,对七种商业化蟹肉进行身份验证,发现了市场上许多黄道蟹被误认为是短尾蟹,造成市场运营的混乱。研究最后表明以标准DNA条形码技术和系统发育分析为基础的程序可做为蟹肉加工产品的检查工具投入到市场管理模式中。

4 DNA条形码在底栖动物方面的应用

在2009年美国密歇根州举行的北美底栖生物学协会年度会议中提到了DNA条形码技术对底栖生物研究的贡献,该技术是目前速度最快准确度最高的分类鉴定技术。在DeWalt等[18]的研究中阐述了DNA条形码技术主要是通过将序列匹配到序列库以帮助鉴定样本。虽然该技术在一些其他方面应用的越来越频繁,但针对底栖生物科学这一新兴领域的研究资料却相对较少,因此研究力图通过分类学家和条形码技术倡导者做出分类和大量的底栖生物样本序列,建立一个可供底栖生物科学家使用的条形码数据库,也将便利的DNA条形码技术扩展底栖生物的应用之中,随着先进采样制度的不断发展,相信在不久的将来便可实现。

5 讨论与展望

DNA条形码技术提供了一个快速而简单的物种鉴定手段,它具有不受发育阶段、个体形态特征和不同物种的限制,一次可以鉴定大量样本并且保证高精确性的优点[19]。从学术方面而言,DNA条形码技术在一些物种鉴定的过程中又会发现隐存物种,提高了物种的多样性,推动了物种分类学和进化学的快速发展;从市场方面而言,由于国际上越来越重视海鲜市场物种的精确鉴定,运用DNA条形码技术可以减少产品的混淆失误,加大了检查力度减少了为谋取利润而有意贴错标签的行为,使得市场贸易更加公平和规范。尽管DNA条形码技术鉴定的成功率不能完全达到100%,这其中存在样本本身DNA条形码难以识别的原因,也存在人为过失,但是和以往繁杂的分类手段相比已经大大提高了鉴定效率。总而言之,在信息网络技术和生物信息学飞速发展的时代,可信息化的DNA条形码技术具有着极大的发展潜力。

[1]李新光,王璐,赵峰,马丽萍,孙永,周德庆.DNA条形码技术在鱼肉及其制品鉴别中的应用[J].食品科学,2012.

[2]Jinbo U., Kato T., Ito M. Current progress in DNA barcoding and future implications for entomology.Entomological Science.2011,14:107-124.

[3]康晓龙,冯登侦.DNA条形码及其在动物遗传多样性中的应用[J].畜牧与兽医生,2012,06:94-07.

[4]Nwani, C.D., et al. DNA barcoding discriminates freshwater fishes from southeastern Nigeria and provides river systemlevel phylogeographic resolution within some species.Mitochondrial DNA.2011,22:43-51.

[5]Zhang J.B. and Hanner R.DNA barcoding is a useful tool for the identification of marine fishes from Japan.Biochemical Systematics and Ecology.2011,39:31-42.

[6]Wang Z.D.,et al.DNA barcoding South China Sea fishes Mitochondrial DNA.2012,23:405-410.

[7]Zemlak T.S.,et al.DNA barcoding reveals overlooked marine fishes.Molecular Ecology Resources.2009,09:237-242.

[8]Cawthorn D.M.,Steinman H.A.,Witthuhn R.C. DNA barcoding reveals a high incidence of fish species misrepresentation and substitution on the South African market.Food Research International.2012,46:30-40.

[9]Cline E.,et al. Marketplace substitution of Atlantic salmon for Pacific salmon in Washington State detected by DNA barcoding.Food Research International.2012,45:388-393.

[10]Dai L.N., et al.,DNA barcoding analysis of Coleoidea (Mollusca:Cephalopoda) from Chinese waters. Molecular Ecology Resources.2012,12:437-447.

[11]Kaneko N.,Kubodera T., and A. Iguchi, Taxonmic study shallow-water Octopuses (cephalopoda:octopodidae)in japan and adjacent waters using mitochondrial genes with perspectives on octopus DNA barcoding. Malacologia.2011,54:97-108.

[12]Sun Y., et al.DNA barcoding of Caenogastropoda along coast of China based on the COI gene.Molecular Ecology Resources.2012,12:209-218.

[13]Feng Y.W., et al.DNA barcoding and phylogenetic analysis of Pectinidae (Mollusca: Bivalvia) based on mitochondrial COI and 16S rRNA genes. Molecular Biology Reports. 2011,38:291-299.

[14]Ni L.H., et al.DNA barcoding and phylogeny in the family Mactridae (Bivalvia: Heterodonta): Evidence for cryptic species.Biochemical Systematics and Ecology.2012. 44:164-172.

[15]Radulovici A.E.,Sainte-Marie B.,Dufresne F.DNA barcoding of marine crustaceans from the Estuary and Gulf of St Lawrence: a regional-scale approach. Molecular Ecology Resources.2009,9:181-187.

[16]Robe L.J.,Machado S.,Bartholomei-Santos M.L.The DNA Barcoding and the Caveats with Respect to Its Application to Some Species of Palaemonidae (Crustacea, Decapoda). Zoological Science.2012,29:714-724.

[17]Haye P.A., et al.Authentication of commercialized crabmeat in Chile using DNA Barcoding. Food Control.2012,25:239-244.

[18]DeWalt R.E.et al. DNA barcoding: a taxonomic point of view.Journal of the North American Benthological Society.2011,30:174-181.

[19]韦健红,吴文如,喻良文,林小桦,李薇. DNA条形码技术在生物分类中的应用[J].广东药学院学,2010,26:430-433.