杜仲的组织培养

张海松 闫岩

(1.江苏省徐州医药高等职业学校实训中心 江苏徐州 221116; 2.徐州创源教育科技有限公司 江苏徐州 221008)

1 概述

杜仲的组织培养是指在无菌条件下,将杜仲的茎尖、叶或种子培养在人工配制的培养基上,给予适宜的培养条件,诱发产生愈伤组织,继而诱导生芽、生根、最后长成完整的植株,达到杜仲迅速繁殖和规模繁殖,满足需求。杜仲组织培养一般选用MS培养基。一般培养条件为:培养基pH5.8,蔗糖浓度0.3%,琼脂0.8%,温度25℃左右培养。

2 原理与流程

植物组织培养是把植物的器官、组织、细胞在无菌条件下培养在人工制备的培养基上,能够继续生长并分化发育成完整植株的过程。本实验是通过愈伤组织的诱导,来完成杜仲的植株再生。

母液的配制→培养基的配制、灭菌和种子催芽以及外植体的选择、消毒→初代培养(再生芽培养)→观察、记录出芽率→继代培养(增殖)→生根培养基的配制、灭菌(生根培养)→再生芽接种→观察、记录生根率→确定杜仲生长最佳条件。

3 操作过程

3.1 来源及处理

杜仲种子选取当年生成熟果实饱满的种子。外植体选用杜仲种子发芽后所得到的无菌苗的芽、茎、叶、胚轴等。外植体一般切成0.5-1cm左右。在培养之前对其进行消毒。

3.2 种子处理

取出种子,用自来水冲洗干净,于30℃的温水中浸泡1天,放在40℃的恒温培养箱中培养2天,浸泡3天后,将发胀种子外面的种皮拨掉,再把种子生根端剪破一个小口,以不损伤胚根为原则。先用75%乙醇消毒1min,用无菌水冲洗三次,再用次氯酸钠溶液消毒20min,用无菌水再冲洗3～4次后,接在种子培养基(无激素)上。

3.3 愈伤组织的诱导

以无菌获得的杜仲的茎、茎尖或叶子为外植体,切成0.5-1cm左右,接种到愈伤培养的培养基里,茎和叶在培养基上几周后开始形成愈伤组织。观察不同的激素浓度对愈伤组织生长的影响。

3.4 初代培养

初代培养即为芽诱导。初代培养时主要用切割茎段法。本实验用杜仲种子培养长出的幼苗。当幼苗长至5cm高时取其下胚轴,切成长0.8cm左右的小段,接种在不同种类和浓度的激素的诱导培养基上,几周后从下胚轴两端长出丛芽,将丛芽转入继代培养基上,准备进行增殖培养。观察并记录不同种类和浓度的激素对芽诱导的影响。

3.5 继代培养

继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁殖培养过程。目的在于繁殖出相当数量的无根苗,最后能达到边繁殖边生根的目的。由于培养物在接近最良好的环境条件,营养供应和激素调控下,排除了其他生物的竞争,所以能够按几何级数增殖。

3.6 生根培养

当材料增殖到一定数量后,就要使部分培养物分流到生根培养阶段。根培养是使无根苗生根的过程,这个过程目的是使生出的不定根浓密而粗壮。将已长大的芽转入不同种类的生根培养基上或用一定浓度生长素浸泡处理后统计其生根状况。

4 结果分析

4.1 种子发芽率的统计

经过多次实验统计,去掉胚乳的种子发芽率为94.0%。

4.2 激素对愈伤组织的影响

4.2.1 NAA(生长素0.1g/L)浓度的影响

NAA为1.0mg/L时,诱导愈伤组织所需要的时间较2.0mg/L以下晚2～3天。NAA在2.0mg/L时,愈伤组织生长较好。NAA在2.5mg/L以下时,愈伤组织出愈时间、颜色、大小和继代后生长差异较大。NAA在2.5～3.0mg/L时,愈伤组织颜色暗淡,没有光泽,继代后生长缓慢。NAA为3.0mg/L时,出愈时间比2.0mg/L晚2天,在仅有少量愈伤组织长出后,逐渐发褐,死亡。故NAA的最佳浓度为2.0mg/L。

4.2.2 6-BA(细胞分裂素0.1g/L)浓度的影响

在6-BA为0.1mg/L时,对愈伤组织诱导率影响不大,但有利于其生长。当6-BA为0.3和0.5mg/L时,愈伤组织生长旺盛,呈奶油色,富有光泽,生活力强;6-BA为1.0mgL时,愈伤组织的诱导和生长明显受到抑制;BA为2.0mg/L时,愈伤组织有50%的出愈率,但长势较差,继代后很快枯死。故6-BA最佳浓度为0.5mg/L。

4.3 激素对芽诱导的影响

下胚轴在诱导培养基中培养20天后,下胚轴的切口处随着培养时间的增长逐渐分化出小丛芽,但在下胚轴的近芽端仅有愈伤组织产生而无芽的形成,三周后统计结果。一般情况下细胞分裂素浓度高于生长素浓度时,有利于芽的形成。BA与NAA适当浓度配合可提高出芽率。由下表可以看出,当6-BA浓度在1.5～2.5mg/L之间,NAA浓度在0.5mg/L左右时,适宜于初代培养。且在0.5mg/L的NAA和2.0mg/L的6-BA时,最好。

4.4 激素对根的影响

以MS(1/2N)和蔗糖浓度2%为基本培养基,添加不同浓度的植物激素(NAA)进行生根培养。培养一周后开始长出不定根,NAA最适合生根的浓度:1.0mg/L。

4.5 光照对芽生长的影响

不同的光照时间对芽的生长也有影响。研究证明,当光照时间为每天12小时左右,光照强度为2500Lx时,生长最旺盛。

5 结语

在本次研究中,用植物组织培养的方法完成了杜仲种子发芽和杜仲愈伤组织的诱导、初代培养、继代培养、生根培养。研究了生长素奈乙酸(NAA)和细胞分裂素6-苄基嘌呤(6-BA)对杜仲愈伤组织诱导、初代培养、生根培养的影响,并确定了不同阶段这两种必要激素的最佳浓度。愈伤组织诱导最佳浓度为:NAA:2.0mg/L,6-BA:0.5mg/L;初代培养最佳浓度为:NAA:0.5mg/L,6-BA:2.0mg/L;生根培养最佳浓度为:NAA:1.0mg/L,最佳光照时间强度为:每天12小时左右,光照强度为2500Lx。

[1]朱致清主编.《植物细胞工程》.化学工业出版社出版.

[2]李浚明.植物组织培养教程.北京:中国农业大学出版社.