新疆肉用绵羊抑制素βA基因多态性与产羔数关联分析

陈宝麒，赵宗胜，贾斌，杨华，张文祥

（1石河子大学动物科技学院，石河子832003；2新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室，石河子832000）

新疆作为我国五大牧区之一，是我国羊肉消耗量较大，并且拥有绵羊品种最多的省区。如具有良好放牧性能、增膘快、产肉多等特点的哈萨克羊，是新疆主要的肉用粗毛型地方品种；以及世界优秀肉用绵羊品种之一的萨福克羊，它具有生长快、母性好、产肉率高等特点，许多新疆地区养殖户将其与当地品种杂交来提高产肉率［1］；而德中杂交羊则是以世界著名的肉毛兼用型德国美利奴羊为父本，以采食性好、生活力强的中国美利奴羊为母本的杂交品种，杂交后代具有产肉率高、适应性强、繁殖力高以及耐粗饲等优良的生产性能［2］。这3种羊以其耐粗饲、适应性广和产肉率高等特点，在新疆北疆地区被作为肉用绵羊大量养殖，但是这些肉用类型羊的产羔数量普遍较低，从而严重制约了新疆绵羊产业的发展。

绵羊产羔数性状遗传力比较低，只有0．1左右，并且大多数绵羊都会受到季节性发情和环境等方面因素的影响，导致了较长的时代间隔时间。所以对于影响产羔数基因的研究，就成为了研究者关注的问题。本实验选择抑制素βA作为候选基因，检测此基因的多态性与产羔数的关联。抑制素βA基因总长度为1．16×105kb，编码区长度为1．2kb，其中外显子1和外显子2长度分别为387和889bp。

在1932年 McCullagh［3］提出“抑制素”这一概念之后，就受到了大量的关注。它是一种由性腺分泌的二聚糖蛋白激素，并且广泛分布于肝脏、肺脏、肾上腺、脑、垂体等组织［4］。抑制素为转化生长因子β（Transforming growth factors，TGF）超家族成员，其生理作用是能有效的抑制垂体促卵泡素（FSH）的合成与分泌，同时它也与卵巢发育和卵泡成熟也有一定的关系。国内外对产羔数性状的研究中发现，这种与排卵相关的基因可以作为产羔性能的候选基因［5］。滑国华［6］对5种山羊抑制素基因进行了研究，结果表明抑制素基因多态性（128G＞A）显著影响山羊产羔数。所以本研究选择抑制素βA为候选基因，利用PCR－SSCP技术对抑制素βA基因5′调控区、外显子1和外显子2区域进行单核苷 酸 多 态 性 （Single nucleotide polymorphism，SNP）分析，并探讨其与哈萨克羊、萨福克羊以及德中杂交羊产羔数性状之间的关联，旨在为新疆肉用绵羊育种和养殖奠定良好的理论基础。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 实验材料

实验羊全部来自于新疆第九师165团，其中哈萨克羊110只，萨福克羊51只，德中美利奴羊78只，每只羊静脉采血5mL，肝素钠抗凝－20℃冻存。用酚氯仿抽提血液全基因组DNA，溶于TE缓冲液，4℃保存。

1．1．2 主要试剂

康为世纪PCR预混液（Mix）、天根pGM－T载体连接试剂盒、天根胶回收试剂盒。

1．1．3 引物设计和PCR扩增

针 对 抑 制 素 βA 序 列 （GenBank：NW＿004080167．1），用primer5．0设计包括5′调控区，外显子1和外显子2共5对引物，对上述绵羊抑制素βA部分序列进行扩增。引物由华大基因科技有限公司合成，引物序列见表1。

PCR反应体系为15μL，体系包括：基因组DNA 0．5μL、上下游引物各0．5μL、康为世纪PCR预混液7．5μL、去离子水6μL。

PCR反应程序：94℃ 预变性5min，94℃变性30s，复性30s（复性温度见表1），72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存备用。

1．1．4 SSCP检测

将3μL PCR产物和8μL上样缓冲液（98%甲酰胺、0．025% 溴酚蓝、0．025% 二 甲 苯 氰 及 10 mmol／L EDTA（pH 8．0））混匀，98℃变性10min，然后－20℃冰浴10min。

冰浴完成后，用交联度（丙烯酰胺：甲叉又丙烯酰胺）为39∶1的10%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳：220V电泳10min清理泳道，然后将冰浴后的变性样220V电泳10min，之后140V电泳12－16h，最后银染显色并置于凝胶成像系统，拍照保存，分析带型。

1．1．5 克隆测序

对于有多态性的PCR扩增片段，选取每个的基因型进行PCR扩增，将扩增产物与pGM－T载体进行连接反应过夜，之后将连接产物转化至大肠杆菌内过夜培养。

挑取单克隆菌落至相应抗性的液体LB培养基中扩大培养，再把扩大培养的菌液进行PCR鉴定，将阳性克隆送上海Ivitrogen公司测序。

1．1．6 数据统计

通过SSCP结果计算各种基因型的基因型频率和等位基因频率；以及群体杂合度（H）、多态信息含量（PIC）、有效等位基因数（E），并采用SPSS 17．0软件的单因素方差分析（One－way ANOVA）及LSD法检验基因型与产羔数之间的关联。

2 结果与分析

2．1 PCR扩增

设计的所有引物扩增条带都很清晰，通过2%琼脂糖胶检测，片段长度与预期大小一致，没有非特异扩增条带，可以直接进行SSCP分析。

2．2 SSCP分析

PCR－SSCP分析结果表明：针对外显子1和外显子2上设计的引物1－1、1－2、2－1、2－2均未发现扩增片段的多态性位点，5′UTR区引物0－2扩增片段检测到存在多态性位点，而且在德中美利奴羊、萨福克羊和哈萨克羊中都呈现3种基因型，分别定义为：AA、BB、AB（图1）。

2．3 测序结果分析

选取基因型AA、BB、AB的PCR产物进行克隆测序，结果显示（图2）：基因型BB和基因型AB与GenBan上NW＿004080167．1的绵羊序列一致。而基因型AA在外显子1的－43和－44bp处发现C→A和G→A碱基突变（图2A、B），在外显子1的－38bp处发现C→A单碱基突变（图2C、D），外显子1的－25bp处发现C→G单个碱基突变（图2E、F）。

2．4 抑制素βA基因3种类型肉羊的遗传多态性

由表2可知：在哈萨克羊、萨福克羊、德中杂交羊中AB基因型频率最高，AA基因型频率次之，BB基因型频率最低，3种绵羊的等位基因A均比等位基因B的频率高。

基因座位在每个群体中的杂合度、有效等位基因数、遗传多态信息含量见表3。由表3可以得知哈萨克羊、萨福克羊、德中杂交羊的遗传多态参数，3种绵羊多态性信息含量分别为0．373、0．374、0．369，均处与0．25到0．5之间，表明该位点在以上3种类型绵羊中是中度多态。

2．5 抑制素βA基因多态性与3种类型绵羊产羔数关联分析

由表4可知：在哈萨克羊、萨福克羊和德中杂交羊中，抑制素βA基因的3种基因型产羔数总体趋势AA＞AB＞BB，且在哈萨克羊和德中杂交羊中基因型AA产羔数与AB基因型和BB基因型的产羔数差异有统计学意义（P＜0．05），AB基因型和BB基因型的产羔数差异无统计学意义（P＞0．05）。萨福克羊AA、BB、AB基因型整体差异无统计学意义（P＞0．05）。

3 讨论

3．1 绵羊抑制素βA基因多态性

抑制素βA基因存在遗传多态性［7］。本研究对哈萨克羊、萨福克羊、德中杂交羊抑制素βA基因的5′调控区、外显子1和部分外显子2进行了PCRSSCP分析。本研究结果显示：3种绵羊的抑制素βA基因5′调控区具有多态性，存在4个碱基突变位点，有3种基因型，分别定义为AA、AB、BB，多态信息含量处于中度多态。经克隆测序结果比对可知，基因型AB和BB的序列和GenBank上NW＿004080167．1公布的绵羊序列一致，而基因型AA发生碱基突变：在外显子1的－43和－44bp中检测到C→A和G→A的连续碱基突变，外显子1的－38和－25bp处分别检测到一个C→A和C→G的单碱基突变，而未发现庄海滨等［8］在绵羊抑制素βA基因多态性分析研究中外显子1第－1位点G→A的单碱基突变位点。而在其他4对引物中，与庄海滨等［8］研究中外显子1第260bp位点C→T的单碱基突变、外显子2第499位点G→A的单碱基无义突变，以及索峰等［9］对巴美肉羊多态性分析中外显子2第857bp位点G→A的单碱基突变位点不同，本研究以上3种羊外显子1和部分外显子2上均没有发现多态性位点。这可能是由于绵羊品种不同造成的少数碱基差异的现象。

3．2 抑制素βA基因与产羔数关系

索峰等［9］对巴美肉羊抑制素βA基因多态性与产羔性状的研究中发现，抑制素βA基因是一个重要的影响巴美肉羊产羔数的基因。董李学等［10］在抑制素A基因遗传变异与双羔性状的的研究中发现抑制素与双羔性状有关联。彭志兰等［11］对抑制素βA与青山羊高繁殖力的关系研究中发现，抑制素与青山羊高繁殖力有一定关系。

本研究将抑制素βA基因作为与绵羊产羔数关联的候选基因进行研究。针对抑制素5′调控区、外显子1和部分外显子2进行PCR－SSCP分析。结果显示哈萨克羊、福克羊、德中杂交羊抑制素βA基因5′调控区均存在3种基因型，其中基因型AA存在碱基突变。3种绵羊的基因型频率和平均产羔数总体趋势AA＞AB＞BB，哈萨克羊和德中杂交羊的AA基因型产羔数显著高于AB和BB基因型（P＜0．05），BB和AB基因型差异无统计学意义（P＞0．05），而在萨福克羊基因型AA、AB、BB差异无统计学意义（P＞0．05）。哈萨克羊和德中杂交羊外显子5′调控区的AA基因型绵羊产羔数显著高于基因型AB和BB的产羔数，说明等位基因A相对于等位基因B为优势等位基因，从一定程度上预示着本实验中AA突变纯合型与新疆地区哈萨克羊、德中杂交羊的产羔数呈正相关，值得做进一步研究。

虽然本研究检测到的碱基突变发生在外显子5′调控区，不改变编码的氨基酸，但这种连续和密集的碱基突变位点，很可能影响启动子区域的重要碱基改变，导致5′调控区核糖开关、小结构元件以及内部核糖体进入位点等高级元件结构的变化。这类元件主要作用是通过其结构或特定蛋白与之相互作用来调控对应mRNA的翻译［12］。我们推测本研究中检测到的突变位点可能通过影响这类元件结构，致使抑制素βA基因mRNA转录本活性降低，导致抑制素βA基因表达量减少，使其对卵巢内FSH拮抗作用减弱，最后获得良好的卵泡质量，使这种抑制素βA基因表达量减少的绵羊产羔数性状显著增高，即：AA基因型绵羊产羔数显著高于AB和BB基因型绵羊。这一结论只是根据有限的试验样本和资料进行推测，还需后期结合抑制素βA基因多态性与mRNA定量表达关联分析进行进一步研究。

由于绵羊产羔数是1个多基因参与调控的性状，目前还未见其主效基因的报道，本研究单从抑制素βA这个基因的变化来阐述其与产羔数的规律和机制显然不合理，所以本研究结果只能说明抑制素βA基因与哈萨克羊、萨福克羊和德中杂交羊的产羔数存在关联，此次发现的抑制素βA基因5′UTR区的碱基突变与该基因对上述3种羊产羔数的调控有一定影响，其具体的影响机制和调控原理有待进一步研究。

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