免疫金法快速检测食品中的甲基对硫磷

邢丽杰，王远，罗小玲

（新疆农垦科学院／农业部食品质量监督检验测试中心，石河子832000）

目前，果蔬中的农药残留一直是公众注目的焦点问题，我国每年有上百起农药污染农产品引起急性中毒事件发生，严重影响消费者身体健康，而高毒农药残留对人体健康引起的慢性潜在危险也正日益引起重视，其中有机磷类农药的品种最多、用量最大［1］，农药残留问题严重威胁人类及周围的生存环境，并已发展成为国内外共同的社会问题［2－3］，急需建立起蔬菜水果中农药残留量快速分析检测方法。

甲基对硫磷是一种产量大、应用广的高毒有机磷酸酯类杀虫剂，由于其毒性较高，近年来已在蔬菜、水果和中药材等作物上禁止使用，但并未禁止生产及在其他经济作物上的使用在蔬菜生产中仍存在农药乱用、滥用的现象，在农产品的进出口贸易、食品安全的监督检测中，甲基对硫磷仍然是日常检测的重要污染物［4］。目前，国内对甲基对硫磷的研究主要集中在微生物降解、多孔材质吸附解毒、风险评估、在植物中的残留动态和效应生物标志物等方面，检测方法则主要集中在气相色谱法、气相色谱－质谱法、液相色谱法、液相色谱－质谱法［5－10］，而免疫学检测方法则很少，而且仅停留在酶联免疫（ELISA）分析方法上，并未见有胶体金法检测的报道。这些方法各有其优缺点，仪器方法准确但是需要配置昂贵的大型分析仪器，同时对人员的技术素质要求极高，一般单位很难达到，且不适于快速、简便地进行大批量样品的检测，ELISA方法只适合大批量筛选样品，因为做一个样品和做几十个样品均需要做整套流程，所用时间相同，并且用到的试剂较多，需要做标准曲线，操作繁琐、费时，影响因素也较多。

本研究选取甲基对硫磷作为研究对象，基于胶体金免疫层析技术，研制出从食品样本中快速检测甲基对硫磷残留的免疫金为例快速测试试纸条，旨在为免疫学方法快速检测有机磷农药残留提供技术依据。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 材料与试剂

Balb／c小鼠（6周龄）购于新疆自治区预防疾病控制中心；甲基对硫磷人工抗原、甲基对硫磷单克隆抗体细胞株（自制）。

甲基对硫磷、聚乙二醇（PEG）20000、福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂（Sigma公司）；牛血清白蛋白（BSA、北京新经科生物公司）；羊抗鼠IgG（上海生物工程有限公司）；硝酸纤维膜（NC膜、Millipore公司）；胶金垫、样品垫、滤纸、吸水纸及PVC底板（上海金标生物科技有限公司）；抗甲基对硫磷单克隆抗体自制。

1．1．2 仪器与设备

酶标仪（450nm，美国Thermo公司）；涡旋振荡器；冷冻离心机（德国Sigma公司）；37℃恒温箱（上海博讯）；50、100、1000μL微量移液器（德国eppendorf公司）；八道移液器（美国Thermo公司）；氮吹仪（美国Organomation公司）；超纯水仪（成都超纯科技有限公司）；磁力搅拌器等。

1．2 方法

1．2．1 试验步骤

1．2．1．1 单抗细胞株的复苏与鉴定

取出冷冻保存的甲基对硫磷单抗细胞株保存管，立即放入37℃水槽中快速解冻，融化后缓缓加入含有预热至37℃DMEM培养基的细胞培养瓶内（稀释比例为1∶10～1∶15），混合均匀后放入CO2培养箱中培养，24h后更换新鲜预热的DMEM培养基，并观察细胞贴壁情况。细胞复苏后每天观察细胞的生长状况，当细胞铺满孔底1／3～1／4时，用间接ELISA法测定细胞株培养上清的效价。

1．2．1．2 单克隆抗体的制备

观察甲基对硫磷单克隆抗体细胞株的生长状况，待细胞生长铺满瓶底时即可用于腹水的制备，将培养好的单抗细胞用生理盐水悬浮后计数，取Balb／c小鼠每只腹腔注入1×106个细胞，15d后当小鼠腹部明显膨大，濒临死亡时采集腹水，并将腹水以1000r／min离心10min，弃去上层的脂肪层，收集中间层液体，即为含有甲基对硫磷单克隆抗体的腹水，用饱和的硫酸铵初步纯化，取proteinG亲和层析柱用磷酸盐缓冲溶液（PBS）冲洗平衡，亲和柱平衡好后将经盐析初步纯化的甲基对硫磷单抗注入，上样结束后用PBS缓冲液洗脱杂蛋白，再用pH 2．7的甘氨酸盐酸缓冲液洗脱结合在柱上的甲基对硫磷单克隆抗体，收集并中和至pH 7．0，得到的IgG用0．2mol／L的PBS进行透析，置于4℃备用，并用紫外吸收法测定抗体的浓度。

1．2．1．3 金标记抗体条件的筛选

调整甲基对硫磷的单抗溶液浓度为1mg／mL，取96孔酶标板编号后，每孔加入100μL直径为10 nm、pH为9．0的胶体金溶液，再加入浓度为1mg／mL的甲基对硫磷抗体溶液，体积分别为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50μL，并作阴性对照，室温下放置30min，再向各孔加入10%的NaCl溶液30 μL，保持红色不变的为抗体胶体金稳定值，选择最小抗体浓度值为抗体标记的用量值。

1．2．1．4 金标抗体的制备

取1只试管，加入直径为10nm的胶体金溶液5mL，调整pH值为9．0，加入甲基对硫磷的单抗振荡15min，再继续加入5%的牛血清白蛋白（BSA）使其终浓度为1%，继续振荡15min；振荡结束后10000r／min离心20min，移除上清；用BL溶液重新溶解至原体积的10%，即为金微粒标记好的单抗。

1．2．1．5 试纸条的组装与条件选择

将甲基对硫磷人工抗原和羊抗鼠二抗在NC膜上划线，分别作为检测T线与质控C线，37℃干燥2h；同时将甲基对硫磷金标抗体点在胶金垫上，37℃真空干燥1．5h；将NC膜、胶金垫、样品垫、滤纸、吸水纸及PVC底板组装好后，切成4mm宽后装卡，置于锡箔袋中，加干燥剂密封，于4℃保存。

对甲基对硫磷人工抗原取0．5、0．7、1．0、1．5 μg／mL的系列浓度进行试纸条的组装与检测实验，对质控线羊抗鼠二抗取0．5、0．7、1．0、1．5μg／mL的系列浓度，结合时间取0．5、1．0、1．5、2．0h进行试纸条的组装与检测实验，甲基对硫磷单抗与胶金垫的结合量取5、10、15、20μL／cm，结合时间筛选取0．5、1．0、1．5、2．0h进行试纸条的组装与检测实验，分别选取最佳的实验条件。

1．2．1．6 检测方法

将试纸条平放，往样本池中加入8 0μL样本，反应10min后判读结果。当样品中甲基对硫磷的质量浓度大于10μg／kg时，则质控C线显色且检测T线不出现条带，结果为阳性；当样品中甲基对硫磷质量浓度小于10μg／kg时，质控C线显色且检测T线出现红色条带，结果为阴性；若质控C线不显色，说明操作不当或者试纸条失效。

1．2．1．7 样本前处理方法

蔬菜样本的处理：取切碎的蔬菜组织样本于均质机以10000r／min均质1min；称取1．0g均质物置于离心管中，加入4mL乙腈，涡旋振荡5min；室温条件下4000r／min离心5min，移取1．25mL上清液至离心管中，氮吹至干；向残留物中加入1mL正己烷，涡动30s，再加入1mL PBS，振荡1min；室温条件下4000r／min离心10min，取下层液相用于检测。

1．2．2 评价实验

1．2．2．1 灵敏度

将甲基对硫磷标准品稀释成5、8、10、15、20、50、100μg／kg，另设阴性对照，用试纸条进行检测。每组做3个重复实验，根据结果判断试纸条灵敏度。

1．2．2．2 样本检测限

对黄瓜、西红柿和上海青，3种阴性样本中添加甲基对硫磷标准品，添加量分别为25、50、100、200 μg／kg，另设阴性对照，按1．2．1．7节所述方法对样品进行处理，用试纸条进行3次重复检测，根据实验结果判定样本检测限。

1．2．2．3 特异性与重复实验

将对硫磷、辛硫磷、氧化乐果、毒死蜱4种有机磷药物分别稀释成10、100、1000、10000μg／kg后用试纸条检测。不同样本每个浓度做3次重复，根据实验结果判定试纸条的特异性。

取试纸条对阴性及10μg／kg甲基对硫磷标准品溶液进行50次重复测定，根据实验结果判定试纸条的重复性。

1．2．2．4 稳定性试验

将试纸条和金标记抗体分装后置于37℃做稳定性试验。在第1、3、5、7天时分别取出，进行竞争反应，观察颜色的变化。

2 结果与分析

2．1 制备甲基对硫磷单克隆抗体

将冷冻保存的甲基对硫磷单抗细胞复苏培养后每天观察细胞的生长状况，当细胞铺满孔底1／3～1／4时，用间接ELISA法测定细胞株培养上清的效价为1∶256，结果见表1。

将培养的甲基对硫磷单抗细胞重悬后注入小鼠的腹腔，待小鼠产生腹水后收集并进行纯化，并用PBS透析，得到的甲基对硫磷单抗用紫外吸收法测得所得浓度为4．43mg／mL，结果见表2。

2．2 试纸条条件的确定

通过抗体标金量的实验测定，确定直径10nm的胶体金溶液pH为9．0时，最佳抗体标金量为25 μg／mL。

通过试纸条测试实验条件的筛选，确定甲基对硫磷人工抗原与NC膜结合的最佳使用浓度为0．5 μg／mL，质控线羊抗鼠IgG最佳使用浓度为1．0 mg／mL，最佳结合时间为2．0h，抗甲基对硫磷金标抗体的包被量为10μL／cm，最佳结合时间为1．0h。

2．3 灵敏度

实验结果如表3所示，该试纸条检测含量在10 μg／kg以上的甲基对硫磷标准品时，结果为阳性；检测含量在10μg／kg以下的甲基对硫磷标准品时，结果为阴性。根据实验结果判定该试纸条的灵敏度为10μg／kg。

2．4 样本检测限

经测定，黄瓜、西红柿、青菜，3种阴性样本使用试剂条进行检测时，检测T线和质控C线均显红色，检测结果如图1所示，结果判定为阴性；阴性样本中甲基对硫磷标准品加标量为50μg／kg时，检测T线不显色，结果判为阳性。根据结果判定该试纸条对蔬菜样本中甲基对硫磷的实际检测限为50 μg／kg。

2．5 特异性

对选取的4种有机磷类药物进行检测后，结果显示本方法只对对硫磷有交叉反应，对其它3种药物均没有交叉反应，表明该试纸条特异性强。用试纸条方法检测甲基对硫磷，多次重复测定结果一致，表明该试纸条批内、批间测定差异小，重复性良好。

2．6 稳定性

采用加速试验进行稳定性研究。37℃保存7d相当于4℃保存6个月。研究发现，胶体金标记抗体在37℃保存7d后检测，检出限没有变化，说明金标抗体在4℃条件下能够稳定保存6个月。

3 讨论

本研究成功研制出了甲基对硫磷快速检测试纸条。该试纸条应用胶体金免疫层析技术原理，样本中的甲基对硫磷在流动的过程中与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，从而抑制抗体和NC膜检测线上甲基对硫磷人工抗原的结合，该试纸条反应时间小于7min，灵敏度达10μg／kg，样本实际检测限为50μg／kg，与对硫磷有一定的交叉反应，分析原因是因为对硫磷与甲基对硫磷官能团中只有1个甲基的差别，结构极其类似，所以会存在交叉反应，属于正常现象，但与其他3种有机磷药物并无交叉反应，表明其特异性很好，具有稳定性好、灵敏度高、结果准确、易于判定、经济实用等优点。

使用气相色谱法分析测定甲基对硫磷：回收率为70%～120%时，加标量在100～500μg／kg，在选择二倍信噪比方法时，检出限为9μg／kg，美国EPA方法为10μg／kg，欧盟和IUPAC为20μg／kg［11］，SPE－液相色谱检出限为460μg／kg［12］，荧光光度法测定水中的检出限为5μg／kg［13］，酶联免疫方法检测甲基对硫磷的检出限为5～30μg／kg［14－15］。本研究制备的试纸条可适用于多种蔬菜样品的检测，其灵敏度达10μg／kg，样本实际检测限为50μg／kg，比较之下，在实际样本的检测中该试纸条的灵敏度比液相色谱高，比气相色谱法、荧光光度法和酶联免疫法较低，但差距不大。虽然气相色谱方法更加准确，灵敏度更好，但高昂的价格和高技术要求限定其只适合于实验室鉴定，该检测方法低廉的成本直接决定其可大面积推广和应用，ELISA方法虽然成本很低，但所用到的试剂多，操作繁琐，而该方法最大的优点是整个过程只需一步加样，反应7min即可判读结果，既可以做1个样品液可以大批筛选，非常适合农贸市场大批量样品的现场快速入场初筛和家庭自用。

［1］郭帅，邵丽华，李静涛，等．蔬菜中有机磷农药残留情况的调查［J］．环境与健康杂志，2008，25（9）：803－806．

［2］Akhtar M，Iqbal S，Bhanger M，et al．Sorption of organophosphorous pesticides onto chickpea huskfrom aqueous solutions［J］．Colloids Surfaces B：Biointerfaces，2009，69（1）：63－70．

［3］Emily B Lisker，Michael P Ensminger，Sheryl L Gill，et al．Detections of Eleven Organophosphorus Insecticides and One Herbicide Threatening Pacific Salmonids，Oncorhynchus spp．，in California，1991－2010［J］．Bull Environ Contam Toxicol，2011，87：355－360．

［4］韩丽君，钱传范，李文明，等．酶联免疫吸附分析法测定黄瓜中的甲基对硫磷［J］．中国农学通报，2005，21（6）：146－148．

［5］吕春红．毛细管气相色谱法测定金银花中敌敌畏、甲基对硫磷和马拉硫磷的残留量［J］．药物研究，2008，5（10）：32－22．

［6］张杰，许家胜，刘连利．气相色谱法快速测定蔬菜水果中甲拌磷、甲基对硫磷残留量［J］．科学技术与工程，2011，13（11）：3049－3051．

［7］赖晶晶，罗丽，程温莹．气相色谱／质谱（GC／MS）测定蔬菜中甲基对硫磷农药和呋喃丹的优化［J］．吉林农业科学，2008，33（2）：53－55．

［8］彭金云，韦良兴，农克良．基质固相分散－高效液相色谱法测定甘蔗中痕量甲拌磷和特丁硫磷［J］．广东农业科学，2009（11）：169－171．

［9］宋文华，刘芳，丁峰．液相色谱－质谱联用法快速检测蔬菜水果中70种农药多残留分析的研究［J］．南开大学学报：自然科学版，2008，41（2）：35－41．

［10］Ligang Wang，Yongchao Liang，Xin Jiang．Analysis of Eight Organophosphorus Pesticide Residues in Fresh Vegetables Retailed in Agricultural Product Markets of Nanjing，China［J］．Bull Environ Contam Toxicol，2008，81：377－382．

［11］蔡潞莎，胡奇，芮三亚．蔬菜中有机磷农药多残留分析：方法检出限的对比研究［J］．食品科学，2006，27（11）：449－454．

［12］HenryK．ROTICH，张卓勇，等．环境水中甲基对硫磷，对硫磷和辛硫磷农药残留的SPE－HPLC分析［J］．分析测试学报，2002，21（5）：50－53．

［13］梅建庭，王化南．荧光光度法测定环境水中微量甲基对硫磷［J］．分析化学，1997，25（1）：82－84．

［14］韩丽君，钱传范，李文明，等．酶联免疫吸附分析法测定黄瓜中的甲基对硫磷［J］．中国农学通报．2005，21（6）：146－149．

［15］王刚垛，何凤生，鱼涛，等．甲基对硫磷ELISA分析方法的建立及初步应用［J］．中国工业医学杂志．2001，14（6）：327－330．