组织工程皮肤研究现状

胡大海，王洪涛，王耘川，官 浩

第四军医大学西京医院全军烧伤中心，烧伤与皮肤外科，陕西西安 710032

皮肤是人体抵御外界损伤的第一道屏障，也是烧伤、创伤过程中最易受损的器官。大面积皮肤缺损会引起体液丧失、水电解质紊乱及低蛋白血症、严重感染等，而皮肤移植是解决这一问题的关键。但由于自体/异体皮肤来源和应用在某些情况下受到限制，人们一直在寻找理想的皮肤替代物。组织工程皮肤(tissue engineering skin，TES)为有希望解决这一问题的途径之一。本文就当前TES的研究、应用进展以及未来可能的研究方向作一综述。

1 组织工程皮肤分类

种子细胞、支架材料以及细胞与支架材料相互作用的方式是构建TES的3个基本要素，而TES从组织构成上分为组织工程表皮(tissue engineering epidermis，TEE)、组织工程真皮(tissue engineering dermal scaffold，TEDS)和组织工程复合皮肤(tissue engineering composite skin，TECS)。根据移植后存活时间，TES可分为永久性和暂时性皮肤替代物。从支架材料上，TES分为生物材料和生物合成材料(包括生物可降解和不可降解材料)，此外，从构建方法上又可分为体外和体内构建。

1.1 组织工程表皮 TEE主要是体外构建的角质形成细胞(keratinocyte，KC)膜片，种子细胞一般来源于皮肤组织活检，通过体外扩增培养3周左右形成细胞间融合的KC膜片。由于KC膜片没有真皮支架支撑，细胞在创面上成活困难，移植修复的创面后期容易引起挛缩和瘢痕增生，因此目前多结合培养于生物可降解材料(如胶原或透明质酸)、人或猪脱细胞真皮基质，以及人工合成的多聚高分子材料上，形成复合结构再移植于创面。1989年美国Genzyme公司首先研发了自体KC膜片，而后有Epidex，Myskin等先后临床应用证实其能够有效修复部分或全层皮肤缺损[1]。研究显示，单纯KC膜片应用于慢性创面时只有15%左右细胞能够锚定于创面并且继续增殖和扩增，移植于新鲜肉芽创面或者清创后创面，则有28%～47%细胞能够维持生长，而移植于预制真皮支架或者有新生真皮创面，则有45%～75%细胞能够维持生长[2－3]。因此，真皮支架在TES构建过程中具有重要作用。

1.2 组织工程真皮 真皮基质应用于真皮缺失的创面修复，可明显提高愈合质量、改善愈合后的皮肤弹性及机械耐磨性、减少瘢痕增生及挛缩等。TEDS主要用来充当修复愈合过程中创面缺失的真皮模版，引导自身修复细胞迁移、增殖和分化，完成真皮的重构和血管化，一般由异体/异种脱细胞真皮和生物合成材料构成。

1.2.1 自然生物材料 自然生物材料TEDS主要来源于异体/异种真皮，具有与人真皮相近的胶原和弹性纤维比例和三维空间结构。未去除细胞的异体/异种生物材料一般只能存活10～15 d。因此，多用于创面的暂时覆盖。有研究试用化学酶消化法或物理方法如反复冻融技术，去除异体/异种真皮基质中的细胞以延长其存活时间，但往往难以彻底去除细胞成分，同时也会破坏细胞外基质和基底膜结构。基底膜是上皮同真皮基质间联系和相互作用的重要部分。研究表明，KC的增殖、迁移以及分化依赖于基底膜中的层黏连蛋白和Ⅳ型胶原等，保存基底膜的脱细胞真皮基质更容易与表皮构建成复合皮肤。目前研制应用比较成熟的异体真皮基质Alloderm采用的是NaCl-SDS脱细胞处理法，细胞去除彻底并保留了基底膜成分，临床使用中证实Alloderm移植后能够与创面基底整合，并可以长期存活而不发生免疫排斥反应[4]。

1.2.2 人工生物材料 主要应用胶原、氨基葡聚糖(glycosaminoglycans，GAG)等，通过不同参数的物理冷冻、风干、化学交联等处理技术，制备不同孔隙率和空间有序的立体网格模拟人真皮结构。另外，可以在制备过程中加载各种生长因子，促进缺失真皮创面的修复与重构。虽然在胶原分子螺旋结构尾端含有可能引发免疫排斥反应的端肽，但采用胶原制备的人真皮替代物临床移植应用显示无免疫原性，没有排斥反应发生。成纤维细胞(fibroblast，Fb)和 KC分泌的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)以及巨噬细胞等均能分解胶原。因此，在制备胶原材料真皮时，加入某些化学交联剂可以保持胶原的生物张力，避免快速降解，但化学交联方法可能会影响Fb的增殖和迁移，从而延缓创面的愈合[5]。在胶原中加入GAG可以减少胶原酶对胶原的降解，增加胶原支架的稳定性，优化材料的机械张力等性能。另有研究显示，在胶原支架构建过程中，加载纤维连接蛋白、弹性蛋白、透明质酸等也可进一步增加胶原的稳定性，同时提高移植后的真皮模拟效果，加强修复组织的生物学功能[6]。

1.2.3 生物合成材料 随着材料科学和工程技术的发展，高分子生物可降解材料逐渐被应用于TEDS的构建，以聚羟基乙酸(polyglycolic acid，PGA)、聚乳酸(polylactic acid，PLA)等为代表，模拟人体真皮构建的三维支架，可以引导修复细胞增殖、迁移，同时随着材料的缓慢降解，逐步被自身修复细胞和细胞外基质取代而完成创面的修复。人体细胞与合成支架材料的相互作用不同于自然情况下体内细胞和细胞外基质间的作用，支架材料的成分、孔隙率及大小、降解速率和降解产物等直接影响细胞的黏附、增殖、迁移和分化。由于这些材料多是疏水性，无法提供修复细胞的黏附位点，影响了真皮的修复和重构。因此，一些生物蛋白分子例如整合素结合受体RGD水凝胶等被整合入支架材料内，用以增加细胞与材料的黏附性[7]。支架材料的降解为修复细胞迁移提供空间和趋化信号，其降解速率最好能与细胞的扩增、迁移速率相匹配，整合素结合位点、MMPs活性和底物在这一过程中协同作用，而支架材料的孔隙率也影响着MMPs的活性。

1.3 组织工程复合皮肤 TECS主要是将培养的KC膜片和不同的真皮基质在体外或体内构建成为具备全层结构的皮肤，以达到修复创面、减少挛缩和瘢痕增生，改善修复后外观和提高生理功能的目的。TECS研制的以Apligraf为代表，是将异体Fb接种于牛Ⅰ型胶原中并覆盖异体KC膜片，但由于排斥反应，只能作为暂时皮肤替代物。另外，比较有应用前景的是 Boyce等[8]关于 Permaderm的研究，其设计以胶原海绵为基质模拟真皮支架，接种自体KC和Fb，Permaderm尚没有完成临床转化和广泛推广应用。临床应用TECS移植修复创面常采用两步法，即先将真皮支架移植于创面，3周左右待完全血管化后再移植自体刃厚皮片或KC膜片，可以有效提高移植成功率。

2 组织工程皮肤的研究方向

近年来，TES研究已取得很大的进展，有些已经应用于临床并取得良好的效果，但与临床应用中期望的TES相比仍有很大差距，主要是缺乏汗腺、皮脂腺等皮肤附件，以及移植后免疫排斥、人工合成材料的降解速率不可控等问题尚待解决。针对上述问题，今后的TES研究将会集中于干细胞的增殖和分化、移植后免疫调控和真皮支架材料仿生等方向。

2.1 干细胞与皮肤附件再生 TES与人体皮肤相比缺少汗腺、皮脂腺、毛囊等，而体内外构建过程中又很难将多种细胞整合于同一块皮肤中，因此，人们不断寻找新的具有多向分化潜能的种子细胞。干细胞因具有无限扩增和多项分化潜能，为构建含有或能够诱导再生皮肤附件的全层TES带来希望。干细胞包括胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)、成体干细胞(adult stem cell，ASC)和诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)。ASC 由于取材容易，不涉及伦理问题，在TES构建中受到重视。起初研究者认为，ASC只能分化为相应组织来源的成熟细胞，但后来大量研究显示，ASC具有多向分化潜能，甚至可以分化为跨胚层组织细胞。骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cell，BMSC)是目前研究最多、应用最广泛的成体干细胞之一，体内外实验证实BMSC可以向包括汗腺上皮细胞在内的多种细胞分化[9]。脂肪干细胞(adiposederived stem cell，ADSC)由于来源丰富、取材简单、具有多项分化潜能而日益受到重视。ADSC具有与BMSC相似的表面标记物，其中包括活化淋巴细胞黏附分子CD166和整合素β1等[10]，整合素β1与表皮干细胞黏附直接相关。虽然尚缺少ADSC大规模临床应用的报道，但体外和动物试验均已证实其具有多向分化潜能并能够促进创面愈合[11]。 此外，潜在的TES种子细胞来源是毛囊干细胞(Hair follicle stem cell，HFSC)。HFSC参与毛囊的周期循环，皮脂腺、汗腺的再生以及创面的愈合。HFSC没有特异的细胞表面标记物，但通常认为K15和K19阳性细胞具有干细胞特性。以HFSC为种子细胞构建TES主要希望能够再生毛囊、皮脂腺和汗腺[12]。iPSC是近年来的研究热点，Fb通过转染4个转录因子基因 (Oct3/4，Sox2，Klf4，c-Myc)，可以重编程转化为类胚胎干细胞，并在一定诱导条件下向多种细胞分化。因慢病毒转染仍存在一定生物安全性问题，使其进一步临床使用受到限制。于是研究者试图采用非转基因方法制备出iPSC。Zhou等[13]将多聚精氨酸转导结构域标记蛋白重复加入含有丙戊酸的培养基中，成功应用小鼠Fb制备iPSC。由于取材广泛，如果能进一步确定其生物安全性，必将是一个具有良好前景的TES种子细胞获取途径。

2.2 免疫排斥与移植物永久存活 研究显示，TES的种子细胞不仅可以通过增殖、迁移、分化等直接参与缺损皮肤创面的修复，同时可释放生长因子等参与新生皮肤的组织重构。但预制的TES中应用的异体种子细胞大多因在移植后的急性期排斥反应中死亡。因此，如何保持外源细胞活力，减少排斥反应，延长TES存活时间是一直以来的重要研究内容，也将是今后相当长一段时间内TES领域的研究热点。近年来，间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)的免疫调控作用日益受到重视。研究显示，MSC低表达Ⅱ型组织相容性抗原，因而被认为是免疫豁免细胞;此外，MSC还通过多种方式参与调节免疫反应[14]。研究证实，MSC可以抑制T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞(natural killer，NK)、树突状细胞(dendritic cell，DC)的增殖，降低T淋巴细胞和NK细胞的细胞毒性，抑制B淋巴细胞成熟和抗体分泌，抑制DC的成熟和活化，动员调节性淋巴细胞(Treg)聚集于淋巴器官和移植物。炎症反应及其相关因子(TNF－α、INFγ)参与了上述过程的调节。研究显示，PGE2、TGFβ、IL－6、IL－10、MMPs、吲哚胺 2，3 双加氧酶(indoleamine 2，3 dioxygenase，IDO)等均可能参与了MSC的免疫抑制调控作用。因此，MSC作为TES种子细胞，有望参与创面修复的同时通过直接或分泌的方式调控免疫排斥反应，获得异体细胞和移植物长期存活的效应。

2.3 支架材料仿生与智能化研究 TES的基质支架可为种子细胞提供黏附、迁移、增殖、分化的微环境，并引导新生皮肤的组织重构。在应用人源性ADSCs治疗糖尿病小鼠皮肤创面实验中发现，采用细胞悬浮液喷洒，对创面愈合没有明显作用，而将细胞接种于三维生物合成支架材料中移植，则能明显加速创面愈合[11]，提示良好的基质材料和支架结构对于维持种子细胞生物学特性和功能具有重要作用。如何应用生物材料模拟体内微环境构建具有最佳参数的结构仿生基质支架，是目前研究的难点和热点。计算机辅助高通量分析技术，可对不同条件下细胞与细胞外基质相互作用方式进行量化研究，为高效精确制备符合种子细胞生物学特性需求的三维基质提供了基本条件[15]。

近年来，支架材料的智能化可控研究技术在不断发展，研究者将生长因子微囊或微球整合于支架材料中，通过对微囊/微球的可控性设计制备，达到移植创面后依据愈合修复时相不同“有序”释放所需生长因子，从而特异性调控种子细胞的迁移、增殖和分化。此外，通过细胞介导的酶化学反应，在基质材料降解过程中伴随释放生长因子分子[16]。这种方式更接近于体内愈合过程，类似修复细胞迁移和增殖过程中，通过分泌MMPs有效降解细胞外基质，进而完成组织的重构和生长因子分泌，因此是按修复细胞微环境需要的分子调控。在支架材料仿生研究领域，另一项值得提及的具有潜在发展前景的是3D生物打印技术。美国生物技术公司Organovo开发出一款生物打印机，可利用患者自身细胞“打印”皮肤。该3D生物打印机有2个生物“打印头”，一个放置最多达8万个人体细胞，被称为“生物墨”;另一个可打印水凝胶“生物纸”，用作细胞生长的支架[17]。生物打印机可以利用计算机辅助设计，最大限度模拟人体正常皮肤结构和需要，通过逐层累积打印，构建全层组织工程皮肤。

3 结语

寻找理想的皮肤替代物一直是烧/创伤领域研究的热点，TES为解决烧伤、创伤引起的大面积皮肤缺损的治疗带来新的希望，但目前与理想的TES尚有一定差距，主要是缺乏皮肤附件，存在免疫排斥，理化性能不稳定等问题。但随着对修复再生细胞局部微环境和生物学特性研究的深入，间质与上皮之间相互作用、干细胞转化等分子机制的不断揭示，以及各种高分子材料和高新技术的应用，未来的TES有望以干细胞为种子细胞，以“仿生智能化”生物高分子材料为皮肤支架，构建出具有完整皮肤功能的理想组织工程产品。

[1]Wood FM，Kolybaba ML，Allen P.The use of cultured epithelial autograft in the treatment of major burn wounds:eleven years of clinical experience[J].Burns，2006，32(5):538 －544.

[2]Hartmann A，Quist J，Hamm H，et al.Transplantation of autologous keratinocyte suspension in fibrin matrix to chronic venous leg ulcers:improved long-term healing after removal of the fibrin carrier[J].Dermatol Surg，2008，34(7):922 －929.

[3]Orgill DP，Butler C，Regan JF，et al.Vascularized collagen-glycosaminoglycan matrix provides a dermal substrate and improves take of cultured epithelial autografts[J].Plast Reconstr Surg，1998，102(2):423－429.

[4]Wainwright D，Madden M，Luterman A，et al.Clinical evaluation of an acellular allograft dermal matrix in full-thickness burns[J].J Burn Care Rehabil，1996，17(2):124 －136.

[5]Valentin JE，Stewart-Akers AM，Gilbert TW，et al.Macrophage participation in the degradation and remodeling of extracellular matrix scaffolds[J].Tissue Eng(Part A)，2009，15(7):1687－1694.

[6]Van der Veen VC，Boekema BK，Ulrich MM，et al.New dermal substitutes[J].Wound Repair Regen，2011，19(Suppl 1):59－65.

[7]Zhou M，Smith AM，Das AK，et al.Self-assembled peptidebased hydrogels as scaffolds for anchorage-dependent cells[J].Biomaterials，2009，30(13):2523 －2530.

[8]Boyce ST，Kagan RJ，Greenhalgh DG，et al.Cultured skin substitutes reduce requirements for harvesting of skin autograft for closure of excised，full-thickness burns[J].J Trauma，2006，60(4):821－829.

[9]Huang S，Lu G，Wu Y，et al.Mesenchymal stem cells delivered in a microsphere-based engineered skin contribute to cutaneous wound healing and sweat gland repair [J].J Dermatol Sci，2012，66(1):29－36.

[10]Rastegar F，Shenaq D，Huang J，et al.Mesenchymal stem cells:Molecular characteristics and clinical applications[J].World J Stem Cells，2010，2(4):67 －80.

[11]Amos PJ，Kapur SK，Stapor PC，et al.Human adipose-derived stromal cells accelerate diabetic wound healing:impact of cell formulation and delivery[J].Tissue Eng(Part A)，2010，16(5):1595－1606.

[12]Joachimiak R，Bajek A，Drewa T.Hair follicle as a novel source of stem cells[J].Postepy Hig Med Dosw，2012，66(1):181 －186.

[13]Zhou H，Wu S，Joo JY，et al.Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins[J].Cell Stem Cell，2009，4(5):381－384.

[14]De Miguel MP，Fuentes-Julián S，Blázquez-Martínez A，et al.Immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells:advances and applications[J].Curr Mol Med，2012，12(5):574－591.

[15]Nakajima M，Ishimuro T，Kato K，et al.Combinatorial protein display for the cell-based screening of biomaterials that direct neural stem cell differentiation[J].Biomaterials，2007，28(6):1048－1060.

[16]Zisch AH，Lutolf MP，Hubbell JA.Biopolymeric delivery matrices for angiogenic growth factors[J].Cardiovasc Pathol，2003，12(6):295－310.

[17]Mironov V，Boland T，Trusk T，et al.Organ printing:computeraided jet-based 3D tissue engineering [J].Trends Biotechnol，2003，21(4):157 －161.