乙肝患者治疗前后检测HBV抗原蛋白特异性T细胞的反应

刘红娟

湖南省岳阳市爱康医院检验科 414000

我国乙肝病毒携带者众多，研究乙肝治疗的方法有着重要的现实意义，抗病毒治疗乙肝是当前治疗乙肝的主要手段，有报道称，乙肝患者的特异性细胞免疫被得到抑制，但是，此方面研究并不是很多，所以，我院对60例乙肝患者展开研究，在治疗前后，监测乙肝患者的HBV抗原蛋白特异性T细胞的变化，具体报道如下。

资料与方法

一般资料:我院从2012年1月～2013年1月随机选择60例慢性乙型肝炎患者，男性患者27例，女性患者33例，年龄区间34～61岁，平均年龄42.21岁。通过诊断，所有患者均符合乙肝诊断标准。对照组为接种乙肝疫苗的健康人20例，男性12例，女性8例，年龄区间32～62岁，平均年龄43.29岁，抗 ～HBe、抗 ～HBc、HBsAg、HBeAg均为阴性，抗～HBs阳性。两组研究对象在性别、年龄、体重、身高等方面均无统计学差异(P＞0.05)。

治疗方法:50例慢性乙肝患者进行抗病毒治疗，其中使用干扰素治疗的患者有28例，核苷酸类似物治疗患者22例。对照组健康人不参与治疗。

检测方法:①使用ELISA方法检测血清标志物HBVM，选用上海复星长征生物技术有限公司生产的试剂，并且严格按照操作流程检测。②使用PCR检测HBV～DNA，检测技术为多聚酶链反应PCR，依然选用上海复星长征生物技术有限公司生产的检测试剂。阳性标准为HBV～DNA病毒数≥103copies/ml，阴性标准为HBV－DNA病毒数＜103copies/ml。③抗原特异性T细胞免疫应答:常规复苏PBMC的方法。事先准备包被有IFγ－1单克隆抗体的96孔，让后将5×103个细胞/孔将细胞放置其中。设置阳性阴性对照孔及实验孔，并设置两个复孔。阳性对照孔加入刺激物植物凝血素PHA，最终浓度是0.2μg/L;阴性对照孔不加入刺激物;实验孔加入 HBcAg、HBsAg、HBeAg，浓度是 5μg/L。并在5%CO和37℃下孵育24小时。第2天将细胞丢弃，并使用浓度为0.05%Tween20的PBS进行6次洗板并拍干。放入PBS稀释生物素化的IFN－1多克隆抗体(1:1000)，在放置在温室里3小时后，再6次洗板。将显色液加入，直到阳性对照孔出现的斑点较深且大小适宜时显色停止。弃掉显色液并洗板2次后风干。使用ELISPOT读板仪读板，阳性反应为阴性对照孔2倍以上。

统计学方法:使用SPSS10.0软件进行数据分析，资料计数为±s，使用t对数据间的差异进行检测，资料数据显示比率为百分率，使用X2比较组间差异性，若P＜0.05视为其差异有统计学意义。

结 果

患者治疗前的所有HBV－DNA＞104拷贝/ml数据，经过3个月后，有51例患者的HBV－DNA水平降至正常范围以内。详细数据，见表1和表2。

表1 治疗前HBV特异性抗原蛋白的反应频率

表2 治疗前后HBV－DNA变化

讨 论

目前研究认为，慢性乙肝患者完全丧失出现HBV特异性T细胞的功能障碍，但具体机制尚不非常明确。对慢性乙肝患者进行外周血检测中能够检测到乙肝病毒特异性CD8+细胞，并且同HBV～DNA浓度成反比例变化［1］。

研究中发现，患者治疗前通过对HBV抗原蛋白进行刺激，结果在HBcAg、HBsAg、HBeAg方面均无反应，或者只产生一种或两种反应，并且强度一般，这说明患者机体已经无法通过自身抗体清除病毒，所以，HBV特异性T细胞反应对于检测慢性乙肝治疗效果有着重要的作用。能够作为检测乙肝治疗效果的重要指标。

1 Fislcaro P，Va/dattac，Bonl C，et al.Early kineticsofinnate and adaptive immune responses during hepatitis B vJtus infection Gut，2009，58(7):974082.