旋毛虫脱氧核糖核酸酶Ⅱ的研究进展

2013-08-15王振普赤峰市农牧业综合行政执法支队024000

当代畜禽养殖业 2013年4期

王振普赤峰市农牧业综合行政执法支队 024000

旋毛虫病（Trichinelliasis）是一种由旋毛虫引起的呈全球性分布的人兽共患寄生虫病，可感染人及150 多种动物，现今该病仍有暴发流行［1］。在我国，其不但被列为三大人兽共患寄生虫病之首（旋毛虫病、囊虫病及棘球蚴病），而且是肉类进出口和屠宰动物首检和必检的一项［2］。我国于1981年首次在厦门从猪的体内发现旋毛虫，以后陆续在黑龙江、辽宁、福建、贵州、河南和湖北等省发现多种动物感染。

自从1835年Page 和Owen 首次发现旋毛虫以来，人们始终在为有效快捷地诊断及预防旋毛虫病做着不懈的努力［3］。旋毛虫传播途径复杂，发育过程中不需要中间宿主，给该病的防制带来极大的障碍。由于旋毛虫的抗原成分极其复杂，而且不能进行体外大量培养和繁殖，这给寻找特异、敏感的诊断抗原带来困难，用于免疫预防的强保护性抗原问题始终未得到解决。随着分子生物学技术的迅猛发展和对旋毛虫研究的不断深入，使得研究旋毛虫功能性基因成为可能。目前，对旋毛虫侵入机体并调整肌细胞分化形成包囊的分子水平作用机制仍然知之甚微，由于新生幼虫期是旋毛虫包囊形成的主要时期，因此分离与鉴定旋毛虫新生幼虫期特异性基因，为进一步探求旋毛虫形成包囊的分子作用机制奠定了基础。核酸酶（nuclease）是指所有可以水解核酸中磷酸二酯键的酶的统称。根据作用底物不同，可将核酸酶分为核糖核酸酶（RNase）和脱氧核糖核酸酶（DNase）；根据催化部位不同，可分为核酸外切酶(exonuclease)和核酸内切酶(endonuclease)。

哺乳动物细胞内存在多种脱氧核糖核酸内切酶，一般该类酶以Ca2+、Mg2+为辅离子，在核苷酸内部位点上裂解染色体DNA，形成特异性梯状(ladder pattern)排列的片段，从而在细胞凋亡中发挥一定作用。目前得到鉴定和公认的核酸内切酶主要有两种：(1)脱氧核糖核酸酶I(deoxyribonu clease I，EC)，简称DNase I；(2)脱氧核糖核酸酶II(deoxyribonuclease II，EC)，简称DNase II。20世纪60年代末，首先在牛胰腺中发现DNase I(最初命名为胰DNase)，随后在牛脾和胸腺中发现了DNase II（命名为脾酸性DNase）。两者的主要区别是最佳pH 值和阳离子依赖程度不同。前者一般需要二价阳离子作为辅助因子，在接近中性条件下活性最高，而后者不需要二价阳离子作为辅助因子，在酸性条件下酶活性较高。

旋毛虫的p43 基因编码的蛋白为脱氧核糖核酸酶Ⅱ。而香港大学的KoRC 教授发现旋毛虫肌幼虫排泄分泌物中具有很强的核酸酶活性，而伪旋毛虫则没有此酶活性（伪旋毛虫是旋毛虫中不能够形成包囊的虫种），并且进一步验证了核酸酶参与了包囊形成的可能性［4］。因此，本文就旋毛虫的脱氧核糖核酸酶研究做一综述。

1 旋毛虫DNaseⅡ的研究进展

郭恒等［5］用地高辛标记cDNA 探针N5 对旋毛虫新生幼虫(NBL)cDNA 文库进行核酸杂交筛选，有13 种基因均为旋毛虫未知基因序列，均含有DNase II 的保守序列。随后利用同样的方法又从旋毛虫成虫（AD）的cDNA 文库中调取了11 条DNase II 基因。而在旋毛虫肌幼虫（ML）中也发现存在一种编码DNase II 的p43 基因。目前从旋毛虫中发现的DNase II 基因最多。旋毛虫为何具有如此众多的DNase II 基因，其意义和原因还不是很清楚。旋毛虫DNase II 在进化关系上与其他物种的DNase II 也有较大的区别：旋毛虫DNase II基因家族形成了一个独特的分枝，而其他物种的DNase II 则在一个大的分枝内。线虫(如C.elegans，细胞凋亡机制和RNAi 的发现均源于它)作为一种模式生物已受到广泛的重视和利用，故对旋毛虫DNase II 进行研究也同样具有着非常重要的意义。DNase II 引发细胞凋亡的机理在于其对染色体DNA 进行特异性切割致使细胞发生凋亡。旋毛虫脱氧核糖核酸酶II 没有引起肌细胞的凋亡，而是引发了肌细胞胶原蛋白基因的异常转录与表达，从而有可能形成了旋毛虫的胶原蛋白包囊。如果说旋毛虫DNase II 以发挥切割DNA 的功能参与旋毛虫包囊形成的话，那么可能的机制就是旋毛虫通过一种或数种DNase II 对肌细胞的染色体DNA 进行有目标的特异性切割，切割的结果是使胶原蛋白基因得以保留而使其他基因遭到破坏，从而使胶原蛋白基因得以被大量转录与表达［6］。

对旋毛虫N5 蛋白的活性中心和关键氨基酸残基推测可能是正确的。证实N5 蛋白能够被ATA抑制，在没有镁离子的条件下，突变产物同样不能对DNA 进行酶切，DNaseⅡ在pH 为5.0 左右时活性最大。旋毛虫的DNaseⅡ活性区域是JFWLVH，关键氨基酸是H，人的DNaseII 活性区域是DHSKW，关键氨基酸是H。两个区域在不同物种都非常保守。通过对旋毛虫N5 蛋白进行酶切实验，证实N5具有和DNaseII 同样的特征。

DNase II 基因也有一定的相似性［7］，可以认定p43 蛋白属于DNaseII 家族成员。p43cDNA 与旋毛虫新生幼虫DNaseII 家族中的13 条基因氨基酸有较高的相似性，而与分离的旋毛虫成虫期DNase II家族的11 条基因也有较高的相似性。目前在旋毛虫中发现的属于脱氧核糖核酸酶II 的基因主要有如下几种：肌幼虫的p43（伪旋毛虫为p38），成虫的T3223 家族（代表性基因为T3223），新生幼虫的N5 家族（代表性基因为N5 和N10）。经过基因库的检索与查询，在目前已分离到DNase II 基因的38 个物种中，除旋毛虫外任何一个物种均不具有超过4 种以上的DNase II 基因，而唯独旋毛虫却拥有一个庞大的基因家族，虽然目前尚不知它们的具体功能，但很有可能与其侵袭与致病有关［8-11］。

p43 氨基酸序列中存在两个糖基化位点，表明该p43 蛋白中存在糖基化现象。1996年Vassilatis发现抗43kDa 蛋白的抗体只有在去糖基化形式下才能识别保护性肽链，认为碳水化合物覆盖了抗原决定簇某些部分，因此糖基化反应通过隐藏功能对相关抗原决定簇起作用，能构成一个免疫系统的侵袭机制［12］。p43 蛋白是用于疾病诊断和免疫的重要物质，碳水化合物是旋毛虫的免疫显性抗原决定簇，有关抗原决定簇或寄生虫侵袭机制以及聚糖的作用等问题，还需进一步研究。

从进化结果来看，p43 基因与美国学者发现的p43 和p49 同源性最高，可以进一步确定这三个基因是同一个基因。同时发现p43 与新生幼虫期的DNaseII 的同源性要比成虫期的DNaseII 高一些。而且发现旋毛虫的DNaseII 序列都存在于一个大的分支内，与其他物种的DNaseII 基因构成了DNaseII基因进化树的两个独立的分支，其真实性和原因及意义有待进一步研究。