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黄粉虫纤溶酶的三维结构模拟与序列分析

2013-08-14韩雅莉

化学与生物工程 2013年9期
关键词:纤溶酶黄粉虫底物

余 磊,韩雅莉

(1.武汉软件工程职业学院,湖北 武汉430205;2.广东工业大学,广东 广州510006)

黄粉虫(Tenebrio molitor)俗称黄粉甲、面包虫,原产于南美洲,属于仓库和贮藏害虫。因其营养成分高,营养含量居各类活体动物蛋白饲料之首,被誉为“蛋白质饲料宝库”。作者所在课题组从黄粉虫体内分离纯化得到黄粉虫纤溶酶[1,2],对其基因DNA序列进行了分析,克隆得到其中一种黄粉虫纤溶酶成熟肽cDNA序列(GenBank登录号:JN662461),并将其表达[3]。在此,利用生物信息学方法,对黄粉虫纤溶酶序列进行多方位分析、确定活性中心的位置,建立了可靠的黄粉虫纤溶酶三维结构模型,并揭示了黄粉虫纤溶酶的纤溶机理。

1 方法

要想了解蛋白质的立体结构,需要将蛋白质溶液结晶,用X-射线衍射分析蛋白质的单晶才能完成。但是蛋白质结晶条件苛刻,而且不是所有蛋白质都能形成单晶,因此实施起来受到限制。利用现代计算机技术,人们可以对已知氨基酸序列的蛋白质三维结构进行预测,同时还能对蛋白质序列中的每一个氨基酸逐个分析。因此,比较蛋白质模建,又称同源模建,逐渐成为目前应用最广的蛋白质三维结构预测方法[4-6]。

将黄粉虫纤溶酶的序列提交到NCBI的自动比较蛋白质模建服务器Blast上,通过程序,自动确定黄粉虫纤溶酶序列活性中心与底物结合部位;将黄粉虫纤溶酶蛋白质序列导入Biosun软件,软件自动选取蛋白质Tryp_SPc[cd00190]为模板,模拟得到黄粉虫纤溶酶的三维结构,并利用Blast比较模板蛋白与黄粉虫纤溶酶的同源性;利用Goldkey软件,对黄粉虫纤溶酶全序列等电点、亲水性、柔性进行分析,基于无模型比对时活性中心氨基酸残基的性质,进一步阐明黄粉虫纤溶酶的纤溶机理。

2 结果与讨论

2.1 黄粉虫纤溶酶序列分析(图1)

图1 黄粉虫纤溶酶序列分析Fig.1 The sequence analysis of fibrinolysin fromTenebrio molitor

由图1可知,黄粉虫纤溶酶序列的活性中心(Active sites)为 H72、D117、S212,底物结合部位(Substrate binding sites)为:D207、S228、G230。

2.2 三维结构模拟与评估

黄粉虫纤溶酶的模拟三维结构见图2,模板蛋白和黄粉虫纤溶酶的同源性比较见表1。

图2 黄粉虫纤溶酶模拟三维结构Fig.2 The analogous 3D-structure of fibrinolysin from Tenebrio moliter

图2中,a、b、c 3个球状模型,分别对应黄粉虫纤溶酶的活性中心S212、H72、D117三个氨基酸残基侧链:羟基、咪唑基、羧基,与胰蛋白酶催化三联体结构一致[7,8]。d、e、f三处肽键链状模型,分别对应黄粉虫纤溶酶的底物结合部位D207、S228、G230。由三维结构可以看出底物结合部位和活性中心均没有α-螺旋和β-折叠(α-螺旋为柱状区,β-折叠为板状区),该区域容易发生形变,在催化过程中与底物结合时,产生诱导契合,符合酶催化理论;酶活中心处于蛋白质中心凹穴处,与通常对纤溶酶活性中心的认识一致[9,10]。本课题组前期研究中曾发现黄粉虫纤溶酶受丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF的抑制,推测其为丝氨酸蛋白酶[2,3],此推测与生物信息学方法找到的活性中心S212相吻合。

黄粉虫纤溶酶的序列为:MKSILFVVFLVASASAVPPFLRKNSLLPDGRIVGGSSISISSVPWQISLQYYGSHICGGSIISANYIVTAAHCTDGLTAGSLTVRAGTSTRGSGGQVVNVARINQNPSYNDRLIDYDISVLQLSSSLSLGSSVAAVGLPSSSTSWSAGTSVLVTGWGTTTEGSSSLPSALQGVNVQIVSQSTCSSAYGSGSITDRMLCAGVTGGGKDACQGDSGGPLVVGNVLAGIVSWGYGCARNGYPGVYSNVPA-LRSYIQQTAGI。

模板蛋白序列为:IVGGSEAKIGSFPWQVSLQYTGGRHFCGGSLISPRWVLTAAHCVYSSAPSNYTVRLGSHDLSSNEGGGQVIKVKKVIVHPNYNPSTYDNDIALLKLKRPVTLSDNVRPICLPSSGYNLPAGTTCTVSGWGRTSEGGPLPDVLQEVNVPIVSNAECKRAYSYGGTITDNMLCAGGLEGGKDACQGDSGGPLVCNDNGRGVLVGIVSWGSGCARPNYPGVYTRVSSYLDWIQKT。

表1 模板蛋白和目的蛋白同源性比较Tab.1 The homology comparison between the template protein and the target protein

由表1可知,Blast评分为186,说明模板蛋白和目的蛋白的同源性比较高;序列覆盖率达到了94%;随机匹配的可能性非常小,仅为2E-62,说明两个蛋白出现相同的序列并非偶然;最大序列的相似度达到51%。表明,以此模板蛋白进行同源模建,所得结构是比较可信的。

2.3 Goldkey软件的序列分析

在黄粉虫纤溶酶三维结构分析中,采用的是同源模建的方法。预测过程中,其它蛋白质与目标预测物的差异,会导致一定程度的偏差。采用Goldkey软件对序列的每个残基逐个计算其特性,虽然无法得到三维结构,但是其数据可靠性更好,更能反映目标蛋白质的特性。用Goldkey软件分别对黄粉虫纤溶酶氨基酸序列进行等电点模拟、亲水性模拟、柔性模拟,结果见图3。

由图3a可知,黄粉虫纤溶酶的等电点为9.16,在人体内正常生理环境下,该酶带正电。而纤维蛋白通常带负电荷,所以黄粉虫纤溶酶很容易靠近纤维蛋白,并与之结合。因此,黄粉虫纤溶酶对血栓有一定的靶向作用。

对于水溶性球形蛋白,亲水值较低的氨基酸,趋向于蛋白质的内部,亲水值较高的氨基酸,趋向于蛋白质的外部。由图3b可知,H72、S212、D207亲水值较低,而且H72和D207是局部亲水值最低点,应该在球蛋白内部;S228、G230亲水值较高,应该在球蛋白外部,与三级结构相符。

图3 等电点模拟(a)、亲水性模拟(b)和柔性模拟(c)Fig.3 The isoelectric point analogue(a),hydrophilicity analogue(b)and flexibility analogue(c)

由图3c可知,活性部位H72、D117、S212的柔性值比较小,几乎是整条链上最小的区域,说明组成酶活性中心的3个氨基酸残基的空间位置相对固定,因而活性中心的相对结构很稳定,在自然状态下不会随意发生变形,底物结合部位中S228、G230的柔性值比较小,说明这两个残基的空间相对位置比较固定,D207的柔性值比较大,这符合酶促反应动力学诱导契合理论。在结合底物时,酶的结合部位和底物的结构都发生了一定的形变(柔性才能形变),两者在空间结构上刚好互补,从而能很好地契合。全链柔性分析表明,黄粉虫纤溶酶的活性中心和底物结合部位符合酶催化机理,从另一侧面证明了活性中心预测的准确性。

2.4 纤维蛋白水解部位结构分析

体内纤维蛋白的溶解是纤溶酶作用于精氨酸-赖氨酸肽键,使之断裂的过程[11,12]。

3 结论

利用生物信息学方法,模拟黄粉虫纤溶酶的三维结构,并对其全序列进行了分析。确定黄粉虫纤溶酶的活性中心为 H72、D117、S212,底物结合部位为D207、S228、G230。黄粉虫纤溶酶属于水溶性球蛋白,其纤溶活性中心位于球蛋白表面凹穴处。推测其催化纤维蛋白水解的机理是作用于精氨酸-赖氨酸肽链,使不溶性纤维蛋白水解成可溶性蛋白。

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