等温滴定微量热检测中样品预处理的优化研究

周 洁，付 强，玉延华

（广西大学 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西 南宁530004）

生物大分子之间或生物大分子与外源物质之间的反应热极其微弱，需要用高度敏感的热分析技术才能测定。目前常用的研究生物分子反应的方法，如表面等离子共振技术（Surface plasmon resonance，SPR）［1］和超速离心分析技术［2］等，均要求蛋白质固定于表面，这就会干扰蛋白质间的结合，或耗费很长时间。等温滴定微量热法（Isothermal titration calorimetry，ITC）是近年来发展起来的一种研究生物分子相互作用的重要方法［3］，其优势在于其非特异性、样品用量小、方法灵敏度和精确度高、实验时间较短、操作简单等。ITC的非特异性有助于新现象和新规律的发现，特别适用于研究生物体系中的各种特异过程；但也会导致实验中产生由反应环境造成的“背景”，干扰性大，难以获得目标反应的理想检测数据。要排除ITC的非特异性产生的不利影响，有必要对检测样品的预处理进行优化，创造一个“相对零背景”的反应系统。

作者以人血清白蛋白（Human serum albumin，HSA）［4］与锌离子的相互作用为研究对象，对ITC检测样品预处理进行了优化研究，以期获得更高效、更理想的检测数据。

1 实验

1．1 试剂与仪器

人血清白蛋白（HSA），Sigma公司；硫酸锌（分析纯），华大；实验用水为去离子水。将Tris－HCl（Solarbio，1×103mmol·L－1，pH＝7．4）配制成5mmol·L－1缓冲溶液，4℃储存备用。

iTC200型等温滴定微量热仪，GE；Lambda 35型紫外分光光度计，Perkin Elmer。

1．2 样品预处理方法

A组：用5mmol·L－1Tris－HCl缓冲溶液配制0．05mmol·L－1HSA溶液200μL、2．5mmol·L－1硫酸锌溶液40μL，直接用于反应。

B组：（1）用5mmol·L－1Tris－HCl缓冲溶液配制0．2mmol·L－1HSA溶液2mL，用透析卡（Thermo，Slide－A－Lyzer○RDialysis Cassette，3500MWCO，0．5～3mL Capacity）进行3次透析，透析缓冲溶液为5mmol·L－1Tris－HCl，每次使用体积600mL，透析条件为：第1次，4℃，2h，更换缓冲溶液；第2次，4℃，2h，更换缓冲溶液；第3次，4℃过夜，透析完成后的Tris－HCl缓冲溶液于4℃储存备用。用专用注射器从透析卡中吸出HSA溶液，采用Bradford法测定HSA实际浓度。以第3次透析后存储的Tris－HCl缓冲溶液为溶剂，将经过3次透析的HSA溶液稀释至浓度0．05mmol·L－1。（2）同法用此 Tris－HCl缓冲溶液配制浓度为2．5mmol·L－1的硫酸锌溶液。（3）测定配制好的HSA溶液和硫酸锌溶液的pH值，若两者不一致，则调节pH值至相差不超过0．05。

1．3 ITC检测方法

A组：在iTC 200软件中的 Advance Experimental Design设置ITC实验参数：0．05mmol·L－1HSA溶液200μL，2．5mmol·L－1硫酸锌40μL；反应温度25℃；总注射次数19次；参照功率5μcal·s－1；搅拌器转速1000r·min－1。结果用 Origin（MicroCal，LLC ITC200）软件进行分析，得到结合常数（Kb）、反应的化学计量数（N）、熵（ΔS）和焓（ΔH）。

图1 HAS－Zn2＋相互作用的ITC检测结果Fig．1 The ITC determination results for HSA－Zn2＋interaction

B组：首先，利用iTC 200软件的Experimental Design模块进行实验预测。Experimental Mode选择Highest Quality，在 Estimate Kd中的 Cell Compound选择 Protein，Syringe Compound 选择 Small Molecule，预估 ΔH 为1kcal·mol－1。键入不同的Cell、Syringe浓度值可得到不同实验预测反应曲线，根据预测曲线选择适合的浓度值。进行实验预测后，选择HSA 0．05mmol·L－1、硫酸锌2．5mmol·L－1作为反应浓度。然后根据预估结果，在Advance Experimental Design中设置ITC实验参数：0．05mmol·L－1HSA溶液200μL，2．5mmol·L－1硫酸锌40μL；反应温度25℃；总注射次数19次；参照功率5μcal·s－1；搅拌器转速1000r·min－1。结 果 用 Origin（MicroCal，LLC ITC200）软件进行分析，得到结合常数（Kb）、反应的化学计量数（N）、熵（ΔS）和焓（ΔH）。

2 结果与讨论

2．1 ITC检测结果

将HSA与硫酸锌分别按A、B组方案进行样品预处理和ITC检测，结果见图1，获得的结合参数见表1。

由图1可知，A组HSA－Zn2＋相互作用过程中反应峰值始终较大，表现出反应一直没有达到平衡状态，难以从滴定曲线判断结合类型，同时没有获得有效的数据（表1），无法对分子间相互作用力进行推断，因此认为A组检测结果不可用。

由图1还可知，B组 HSA－Zn2＋相互作用的特征性的峰序列表现出良好的台阶，并最终显示滴定接近平衡，反应饱和，残余的热效应符合稀释峰的特征，可以通过Origin软件的非线性回归分析减掉。表1数据表明，B组 HSA－Zn2＋为放热反应［5］，只有一个结合位点，是一个焓驱动的过程（ΔH＜0），同时根据公式ΔG＝ΔH－TΔS［6］，Gibbs结合能ΔG＜0主要由ΔH＜0贡献，因而推断，在本实验设计的浓度和比例下，HSA与Zn2＋之间主要的作用力为氢键和范德华力［7］。

表1 HSA－Zn2＋相互作用的结合参数Tab．1 The binding parameters for HSA－Zn2＋interaction

2．2 讨论

在ITC检测实验中，良好的反应系统是得到理想结果的关键，但要实现“绝对零背景”很难，而创造“相对零背景”的系统则可以通过对样品预处理的优化来实现。经过透析、浓度测定、pH值调节等一系列预处理的B组HSA－Zn2＋获得了良好的ITC检测结果。

（1）HSA粉剂中的甘油、防冻剂等辅分可能对另一反应物产生作用或对整个反应体系产生影响，从而产生额外的热量，成为不属于特异性反应的背景热。而其它通过提取及纯化的蛋白样品由于提取试剂的影响，同样存在背景热。本研究中蛋白经过3次透析后，不仅被Tris－HCl缓冲溶液充分溶解且与缓冲溶液体系达到了很好的平衡。利用第3次透析的缓冲溶液作为另一反应物的溶剂保证了两种反应物在体系上达到了更好的一致性，是实现“相对零背景”系统的关键。

（2）由于ITC检测的是活性蛋白与小分子作用所产生的反应热，需要提供给分析软件的数据只有两个反应物的浓度值，因此，透析后对蛋白浓度再次进行定量以得到准确的浓度非常必要。

（3）由于不能排除反应物在被缓冲溶液溶解或稀释后是否会发生pH值变化，相对于生物分子间相互作用的微量结合热，酸碱中和热无法忽略，会成为干扰，因此在ITC实验中，严格调控pH差值在0．05之内很重要。

（4）透析可以选择透析袋或透析卡，透析袋价格便宜，但使用前需要进行预处理，导致透析步骤增加，影响样品质量和实验重复性的因素增多。透析卡价格较贵，但人为影响小，便于进行质量控制，提高实验重复性，对于重要样品，建议使用透析卡等预制品。

3 结论

等温滴定微量热法（ITC）是近年来发展起来的一种研究生物分子相互作用的重要方法。在研究蛋白质与外源小分子的相互作用时，优化样品的预处理，通过将蛋白质进行3次透析、准确定量蛋白质实际浓度、调控pH值和使用第3次透析缓冲溶液作为溶剂，实现了“相对零背景”的反应系统。将未优化组和优化处理组样品所进行的ITC检测结果进行比较，表明进行样品预处理的优化对获得有效的检测结果十分必要。

（致谢：感谢何容博士、任薇薇博士对本研究的理论指导和技术支持。）

［1］王海明，钱凯先．表面等离子共振技术在生物分子互作研究中的应用［J］．浙江大学学报（工学版），2003，37（3）：354－357．

［2］Ma C，Hou H，Tian W，et al．Expression，purification and characterization of critical domains of Munc 13－1［J］．Acta Biochimica et Biophysica Sinica，2007，39（8）：617－623．

［3］Falconer R J，Collins B M．Survey of the year 2009：Applications of isothermal titration calorimetry［J］．J Mol Recognit，2011，24（1）：1－16．

［4］王娅，蒋晓慧．药物小分子与人血清白蛋白作用的研究手段进展［J］．广东化工，2012，39（16）：76，33．

［5］Sturtevan J M．Heat capacity and entropy change in processes involving proteins［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1977，74（16）：2236－2240．

［6］de Azevedo W F，Dias R．Experimental approaches to evaluate the thermodynamics of protein－drug interactions［J］．Curr Drug Targets，2008，9（12）：1071－1076．

［7］冯素玲，袁道琴．阿魏酸哌嗪与牛血清白蛋白相互作用的研究［J］．分析测试学报，2009，28（7）：78－82．