从发酵液中提取达托霉素的工艺优化

常 亮，魏增辉，李敏娜，梁 冬，仲伟潭

（微生物药物国家工程研究中心 河北省工业微生物代谢工程技术研究中心华北制药集团新药研究开发有限责任公司，河北 石家庄050015）

达托霉素是一种新型的环脂肽类抗菌素，具有独特的抗菌机制。达托霉素由连接到一个环状13－氨基酸肽的N－末端色氨酸上的癸酰基侧链构成，其中肽环或羧酸肽环是由氨基酸和非蛋白质源氨基酸通过酰胺键或酯键构成的［1］。由于脂链和疏水性基团的存在，达托霉素具有一定的脂溶性，容易与细菌磷脂层反应，因而具有良好的抗菌效果。

达托霉素结构复杂，稳定性差，制备非常困难。国外采用微生物发酵法，通过离子交换树脂以及疏水介质提纯达托霉素［2］，国内中科院上海有机化学研究所采用固相合成方法首次化学合成达托霉素［3］，福建微生物研究所通过化学半合成工艺路线开发达托霉素［4］。上述工艺路线复杂、周期长、成本高、产量低，距离产业化仍有一段距离。文献［2］报道，达托霉素在pH值较低情况下，可形成胶束状态。作者利用这一特性，采用微生物发酵法生产达托霉素，将达托霉素富集到菌丝体，对从发酵液中提取达托霉素粗品的工艺条件进行了研究。

1 实验

1．1 试剂与仪器

达托霉素发酵液为华北制药集团新药研究开发有限责任公司提供。

磷酸二氢钾、氢氧化钠、盐酸、珍珠岩、正丁醇均为国产分析纯。

双量程电子天平、FE20型实验室pH计，梅特勒－托利多仪器上海有限公司；LC－2010AHT型高效液相色谱仪，Shimadzu；TGL－16G型高速离心机，上海安亭科学仪器厂。

1．2 方法

用1mol·L－1盐酸调节达托霉素发酵液为酸性，离心分离后的澄清滤液几乎检测不到达托霉素，收集富含达托霉素的菌丝体；对菌丝体进行浸泡，加入正丁醇萃取转相；收集正丁醇萃取溶液，加入丙酮，结晶、干燥，制得达托霉素粗品。

对比不同溶剂、不同pH值缓冲溶液对菌丝体的浸提效果；同时对达托霉素的结晶条件进行研究，以优化适合工业化的提取工艺路线。

2 结果与讨论

2．1 溶剂对浸提效果的影响

2．1．1 溶剂的选择

达托霉素偏酸性，在中性pH值下分子带负电荷，因而具有极好的水溶性。根据此特性，实验选择pH值7．0的缓冲溶液以及不同体积分数的乙醇、甲醇对菌丝体进行浸泡。

取达托霉素发酵液5L，调节pH值为3．0，离心分离得菌丝体。取菌丝体，均匀分为4份，以等体积的不同溶剂浸泡菌丝体30min，离心分离收集上清液，测定达托霉素浓度，计算浸提收率，结果见表1。

由表1可知，60%乙醇以及40%甲醇对菌丝体的浸提收率较高。考虑使用溶媒对环境的污染以及工业化生产成本问题，确定选用缓冲溶液作为溶剂。

表1 不同溶剂浸提菌丝体的效果对比Tab．1 Comparison of extraction efficiency for different solvents

2．1．2 不同pH值缓冲溶液对浸提效果的影响

取达托霉素发酵液3L，调节pH值，离心分离菌丝体，用不同pH值的等体积的缓冲溶液浸泡1h，离心分离收集上清液，测定达托霉素浓度，计算一次浸提收率；将上述离心分离所得菌丝体再浸泡1h，离心分离，测定上清液中达托霉素浓度，计算二次浸提收率。结果见表2。

表2 不同pH值缓冲溶液对菌丝体的浸提效果对比／%Tab．2 Comparison of extraction efficiency for buffer solution with different pH values／%

由表2可知，pH值6．5～7．5的缓冲溶液对达托霉素浸提效果均较好。因此，确定适宜的缓冲溶液pH值为6．5～7．5。

2．2 结晶条件的确定

在接近等电点时，达托霉素转入正丁醇相，同时可去除部分色素及杂蛋白。按照1．2方法制备达托霉素粗品，测定不同达托霉素的结晶条件（丙酮加量、结晶方式）下所制备的达托霉素粗品的质量和收率，结果见表3。

表3 不同结晶条件下达托霉素粗品的质量和收率Tab．3 Quality and yield of daptomycin crude under different crystallization conditions

由表3可知，随着丙酮加入量的增加，结晶收率相应提高，但丙酮加入量过多，会影响杂质的去除效果，粗品纯度有所下降。冷藏结晶较常温结晶对达托霉素杂质有更好的去除作用。因此，确定适宜的达托霉素结晶条件为以5～8BV丙酮冷藏结晶。

3 结论

确定了从发酵液中提取达托霉素的工艺条件为：调节达托霉素发酵液为酸性，对分离的菌丝体采用pH值6．5～7．5的缓冲溶液浸提，加入正丁醇进行萃取使达托霉素转相，收集正丁醇萃取溶液加入5～8 BV丙酮进行冷藏结晶，干燥后制得达托霉素粗品。该工艺路线简单、经济，适合工业化生产。

［1］史丽娟，石磊．新型抗革兰阳性菌药物——达托霉素［J］．中国医药导刊，2008，10（7）：1100－1101．

［2］T·J·凯莱赫，赖正吉，J·P·德库西，等．高纯度脂肽、脂肽胶束及其制备方法［P］．CN 1 404 487A，2003－03－19．

［3］徐红岩，陆婷婷．一种达托霉素的合成方法［P］．CN 101 235 080A，2008－08－06．

［4］郑卫，程元荣，周剑，等．一种流加癸酸盐发酵达托霉素的方法［P］．CN 101 880 703A，2010－11－10．