超分子组装：设计与制备荧光传感器的新途径

贾 兰，刘晓华，马彦龙，朱晶心

（太原理工大学材料科学与工程学院，山西 太原030024）

荧光传感器因其灵敏度高、不损坏样品、使用方便，在检测中的应用越来越广泛。一个真正具有实用价值的荧光传感器可简单地分为3个部分［1］：（1）外来物种的识别部分（Receptor）；（2）荧光报告部分（Fluorescence reporter）；（3）连接部分（Spacer）。

荧光报告部分直接影响着检测的灵敏度，识别部分则与检测的选择性息息相关，而连接部分对报告部分与识别部分在空间上的分布也会影响到检测结果。超分子组装与传统有机合成构建荧光传感器最大的区别在于连接部分不同［1］。传统的化学有机合成构建的传感体系，报告部分与识别部分直接相连或通过一定的链段连接起来，本质上是共价连接的方式。鉴于其连接部分本质上的刚性，为了提高选择性而对结合位点进行修饰可能会影响到荧光报告基团的发光性能，因此很难对体系进行进一步的升级和优化。而通过非共价作用连接报告部分与识别部分即以超分子组装取代有机合成，可以确保识别部分与报告部分空间上的接近从而有利于电荷／能量的传递。

与共价连接的方式相比，超分子组装的方式可以避免共价连接灵活性不足的缺点，将荧光报告部分和识别部分作为亚单元或模块分别进行设计和合成，建立模块化的识别部分库和报告部分库，然后根据待测物的特点选择识别部分与报告部分，将它们组装起来，从而可以筛选出最适合特定检测物的组合，这种方式也被称为 “从部分到整体”或“自底向上（Bottom－up）［2］”方式。

在超分子化学中，通过选择组装单元种类以及调整浓度或比例可以方便地实现体系的制备与优化过程，而且组装过程中往往会产生新的结构和功能，从而产生新的潜在应用。通过不同分子之间的组装可以获得各种复杂的、功能集成的新型组装体，超分子组装已成为设计与制备荧光传感器的新途径。

1 基于超分子组装体的荧光检测模式

按照组装体在荧光检测过程中发生的结构变化，可简单分为以下3种检测模式：

1．1 基于竞争反应的指示剂取代检测

该检测模式中，荧光报告部分（指示剂）与识别部分（受体）先通过非共价作用形成组装体系，待测物加入后发生动态的取代反应，待测物将荧光报告部分置换出来，引起荧光信号的变化，这种传感模式被称为基于竞争反应的传感聚集体或指示剂取代检测（Indicator displacement assay，IDA），如图1所示［3］。指示剂与受体结合时的光学性质与其在媒介中的游离状态有所不同，并且受体与待测物和指示剂都有结合作用，但结合能力不同，因而寻找合适的指示剂与受体是该检测模式的关键所在。

这种检测模式最早的报道见于乙酰胆碱荧光检测体系［4，5］。Anslyn课题组依据竞争免疫测试中基于抗原的生物传感模式发展衍生出IDA概念，并应用其原理开发出大量的光学传感器并首先用于检测水溶液中的柠檬酸盐［6］。

图1 指示剂取代检测示意图Fig．1 Schematic of the indicator displacement assay

此后，研究人员陆续实现了许多有机物及无机物的检测，如磷酸盐、碳酸盐、糖类以及手性氨基醇等。此外，IDA的应用中还衍生出一类金属离子络合型受体，指示剂可与金属中心以及受体同时产生配位作用，最常见的是Zn（Ⅱ）、Cu（Ⅱ）配体，其它金属构成的配合物用于检测的报道也很多。

IDA也可应用于其它体系，如荧光基团与金纳米粒子的组装体系。Chen等［7］报道了一种荧光染料尼罗红吸附在金纳米粒子表面检测巯基分子的方法。在pH值4．0条件下，尼罗红非共价吸附在金纳米粒子表面形成组装体，荧光通过能量转移被有效猝灭。加入巯基分子以后，巯基分子将尼罗红取代，荧光逐渐恢复，可以用于检测巯基乙胺和同型半胱氨酸，检测极限达到10nmol·L－1。利用相似的策略，研究人员将荧光共轭聚合物稳定的金纳米粒子［8］、近红外染料分子吸附在金纳米粒子表面［9］以及将两亲性聚合物吸附在金纳米粒子表面检测巯基分子［10］，都有很好的检测灵敏度和选择性。此外，该策略也可用于检测蛋白、离子等。

受到指示剂替代检测的启发，Dsouza等［11］从主客体识别角度发展出一种新型的超分子串联酶测定方法（Supramolecular tandem enzyme assays）。该方法可以看作是指示剂取代的一种时间分辨版本，因为竞争试剂不是直接加入，而是随酶催化反应产生的，其浓度随时间动态变化。该方法是基于荧光染料与酶催化底物和产物对大环主体如杯芳烃或葫芦脲的竞争结合，包括两种检测类型：如产物与大环主体的结合力高于荧光染料与底物，则在催化过程中，底物的转化使产物进入大环主体，而荧光染料被竞争出来，这种类型被称为产物选择性超分子串联检测；如底物与大环主体的结合力高于荧光染料和产物，则催化过程中，底物的转化使荧光染料进入大环主体，这种类型被称为底物选择性超分子串联检测。每一种检测类型都有荧光开和荧光关两种实现方式。目前这种方法可以检测的酶种类包括氧化酶（EC1）、转移酶（EC2）、水解酶（EC3）、裂解酶（EC4），也可用于检测与酶相关的底物、产物或辅因子。

1．2 基于超分子组装体解组装的荧光检测

该检测模式中，荧光报告部分与识别部分通过非共价作用组装，待测物加入后诱导组装体解组装，产生荧光信号的改变以实现检测。一般通过两种方式实现：待测物将识别部分结合走或待测物诱导识别部分水解，前者适用于检测生物分子之间的特异性相互作用，后者则主要用于检测具有水解作用的酶。报告部分多采用荧光共轭聚电解质（CP）或聚集诱导发光（AIE）分子。

生物素－亲和素（Biotin－Avidin）之间的相互作用是蛋白质结合最常用的类型之一。Chen等［12］在阴离子共轭聚电解质中加入微量含有Biotin的带正电猝灭剂，静电组装后荧光被猝灭。加入Avidin后，猝灭剂被结合走，荧光恢复，可用于检测两种蛋白的相互作用。通过这种方式也可以检测其它分子间特异性的相互作用，如硼酸衍生物与糖类、肝素与鱼精蛋白等。

Wang等［13］报道了基于共轭聚电解质的组装体用于检测乙酰胆碱酯酶的方法。阴离子共轭聚电解质与带正电荷的底物乙酰胆碱通过静电作用组装，修饰了猝灭剂的底物使荧光猝灭。加入酶后，底物被水解，猝灭剂基团带负电，与共轭聚电解质静电排斥，组装体解组装，因而荧光恢复，这一过程可用于检测酶及其抑制剂。利用对酶底物修饰猝灭剂的策略或酶的底物和产物与共轭聚电解质不同的结合效应，还可检测核酸酶、磷脂酶C以及蛋白酶。

2001年，唐本忠等偶然发现了聚集诱导发光（AIE）现象，AIE分子作为一种新型的荧光染料开始被研究和应用。Zhang等［14］报道了一种AIE分子检测DNA以及核酸酶的方法。在季铵化硅杂环戊二烯（Silole）中加入单链DNA，通过静电作用构建组装体，荧光发射增强，增强的程度与DNA链长度相关。加入核酸酶将DNA链剪切成寡聚核苷酸，静电作用减弱，组装体解体，聚集效应减弱，AIE分子荧光发射强度降低。这一过程可用于检测核酸酶以及筛选抑制剂。此外，AIE探针也可以利用酶水解前后产物和底物与AIE分子不同的结合效应，用于检测水解酶活性，如乙酰胆碱酯酶、碱性磷酸酶、胰蛋白酶等。

1．3 基于构象变化效应的荧光检测

有些待测物加入到超分子体系中，不会使组装体解组装，而是使识别部分的构象发生变化，选择对构象敏感的报告部分，就可以产生荧光信号的改变。比较常见的对构象敏感的报告部分有荧光共轭聚合物中的聚噻吩类或AIE分子，而构象转变多是由于核酸适配体与底物结合引起的。

聚噻吩的光学性能与它的共轭主链的构象相关［15］，可以用于检测与聚噻吩结合引起构象转变的转化过程或物质。常见的转化过程有DNA双链杂交、DNA构象从G－四联体到双螺旋的转变等，常见的检测物主要是引起核酸适配体构象变化的物质，如钾离子、汞离子、凝血酶等。Ho等［16］报道了阳离子聚噻吩无需荧光标记特异性地检测凝血酶，这是一个非常典型的例子。非特异性的蛋白如BSA存在时，聚噻吩会与核酸适配体DNA链静电结合，形成平面结构，此时荧光较弱，溶液呈红色；加入凝血酶时，核酸适配体构象发生转变，形成G－四联体，阻碍聚噻吩的链形成平面结构，导致颜色转变为橙色，荧光强度增大。该方法的检测限达到2×10－15mol·L－1，且核酸适配体具有良好的选择性。随着核酸适配体技术研究的深入，这一方法的适用范围将进一步扩大。

AIE分子对构象的转变也很敏感，因为不同构象的AIE分子聚集程度不同，从而具备不同的发光性能。Tang等［17，18］报道了 AIE分子用于检测BSA在表面活性剂存在条件下的解折叠过程、DNA构象从G－四联体到双螺旋的转变。Xu等［19］通过汞离子核酸适配体构象改变诱导的AIE荧光强度改变来检测汞离子。

2 新的设计方向

2．1 识别或报告基团的联用

超分子组装最大的优势在其灵活性，单一的非共价作用或许不能提供足够的结合力，但可能通过多结合位点以及多种作用力协同作用来达到足够强的结合力。识别或报告基团的联用就是多结合位点或作用力协同作用的体现。

2．1．1 荧光报告基团的联用

荧光报告基团的联用可以提高检测的灵敏度，一般通过荧光共振能量转移（FRET）实现。Feng等［20］将荧光共轭聚合物用于检测特定序列的DNA，荧光报告基团包括阳离子共轭聚合物、DNA茎环结构末端的荧光标记以及插入双链DNA会产生荧光的溴化乙锭（EB）。开始时，荧光标记的DNA茎环结构与带正电的荧光共轭聚合物之间通过静电作用组装，发生从共轭聚合物到荧光标记的FRET。当加入互补DNA链后，茎环结构构象改变，EB插入新形成的双链DNA中，发生两步的FRET。这种方法可以提高检测的灵敏度和选择性，即便只有一个碱基错配也可以准确地检测出来。

Vandienst等［21］设计了荧光共轭聚合物、量子点与单链DNA上荧光标记的连续两步FRET来检测DNA杂化过程。带正电的荧光共轭聚合物有两个作用，一方面作为捕光天线来促进第一步FRET中量子点的发射，另一方面提供正电荷表面使DNA链与聚合物／量子点复合体静电组装，从而发生第二步FRET，为提高检测灵敏度和选择性提供了很大的可能。

2．1．2 识别基团的联用

目前还没有通过非共价作用实现识别基团联用的报道，但已有一些基于主客体识别检测体系中识别基团共价联用的范例。Arduini等［22］将β－环糊精和杯［4］芳烃经o－和p－二甲苯基桥联，发现同单一的环糊精主体相比，这种传感器表现出对某些客体分子更好的识别能力，如其与水中苯胺基萘磺酸和对甲苯胺基萘磺酸的结合常数增大了400倍。这是因为，杯［4］芳烃的引入扩展了传感器的分子识别范围，增强了其与客体分子的疏水相互作用，因此适用范围更加广泛。但主体之间也不一定都表现出协同作用，荧光基团与受体空腔形成包结配合物的程度会影响传感器的传感能力，荧光基团选择不恰当时，这种多主体荧光传感器的优势就无法体现［23］。

将环糊精二聚体、三聚体甚至多聚体作为荧光传感器的识别部分也得到了研究，环糊精空腔间协同作用的存在使其可以识别一些大分子。Miranda等［24］首先制备了环糊精三聚体，再在每两个环糊精之间的连接臂上修饰荧光基团丹酰，制成了多主体荧光传感器。在该体系中，同时存在3个结合位点和1个相对较大的疏水区域，保证了对客体分子的高选择性和高灵敏度识别。此外，也有研究将冠醚与杯芳烃桥连作为荧光传感器的识别部分用于检测离子，这可能成为超分子荧光传感器研究的新方向。

2．2 构建阵列实现多组分检测

前面介绍的检测方法都是遵循特定的“锁钥”原理，识别过程是通过特异性作用发生的。但在很多情况下，对于复杂的待测体系如生物体液、气味性分子等，难以实现一一对应的特异性识别。阵列方法的优越性在于可以实现复杂体系中多种组分的同时检测。超分子组装的方式容易实现体系的制备与优化，构建阵列也比合成的方法更加简单易行。

基于这种思想，Rotello发展出“化学鼻”的检测阵列［25］，其设计的中心思想在于通过超分子组装的方式构建阵列以及通过线性判别分析进行区分识别。Rotello等［26］制备了6种不同功能团修饰的带正电荷的金纳米粒子，金纳米粒子与阴离子荧光共轭聚电解质静电组装构建阵列用于检测蛋白。在组装体系中加入多种蛋白，不同尺寸和电荷的蛋白对组装体系产生不同的荧光响应，构建阵列可以区分纳摩尔级别的蛋白，在55种蛋白中可以区分52种，准确率为94．2%。以绿色荧光蛋白代替荧光共轭聚合物［27］，可减少荧光基团与血清中不同蛋白的非特异性作用，并避免了聚集引起的自猝灭以及激基缔合物的形成，检测效率更高。这种方法被进一步用于区分细菌以及细胞，如区分同基因型的正常细胞、癌细胞以及转移癌细胞等，有望用于癌症检测。

荧光团取代的方式使灵敏度受限于报告基团本身的光学性能。为了克服这一限制，Grandini等［28］运用了酶放大阵列检测（EAAS）来进一步提高灵敏度。这种EAAS结合化学鼻检测的多样性，可以测定一系列的生物相关蛋白，在缓冲溶液和稀释尿液中的检测极限达到1nmol·L－1。

2．3 传感器器件化

荧光传感器的另一个研究趋势就是将分析方法器件化，这样可以实现传感器的重复使用，减少污染，方便检测。一般超分子组装是在溶液中应用，在界面或表面实现超分子组装就向器件化迈进了一步。早在1999年Tecilla和Tonellato课题组就提出“模板辅助自组装传感器（Template－assisted self－organized chemosensor）”方式［29］，借助于模板的作用，不需要或只需要简单的合成步骤，就可以将批量的报告基团和识别基团在模板上组装，并筛选出对特定应用最适合的组合。迄今为止已经发展出多种模板，包括胶束聚集体、单分子薄膜、玻璃以及纳米粒子［2］。此外，研究者将β－环糊精和芘同时固定化到石英玻璃表面的壳聚糖薄膜上［30］，得到了对硝基甲烷特异响应的新型薄膜材料，这种材料可以长期储存并反复使用。

Crego－Calama课题组在玻璃表面构建自组装单层膜，通过微打印技术来沉积不同的荧光团以及小分子组合作为检测多种离子检测的平台［31］。该研究结合了微打印与阵列检测的优势，可用于多种检测体系，对于分析器件的微型化也有着重要的意义。研究者还进行了在纳米粒子表面通过超分子组装构建传感器的研究，这种策略将纳米技术、智能材料以及超分子化学结合起来，为传感器的设计与检测模式带来新的可能。

3 结语

超分子组装减少了有机合成的步骤，为快速构建和优化荧光传感器提供了新的途径。多样的组装单元与组装方式也利于获得各种复杂的、功能集成的新型组装体。超分子组装在生物检测方面的应用涵盖了离子、小分子、蛋白、各种酶甚至细胞、细菌等，在食品工业、环境监测、临床诊断等多个领域中都有着巨大的应用潜力。

但是，超分子组装在生物检测中的应用研究逐渐深入的同时，与实际应用目标相结合的荧光检测技术依然存在一定的局限性。对于检测器件的设计、制备以及系统评价方面的研究仍然不多。实现界面或表面可控超分子组装，开发以应用为目的的快速灵敏、可反复使用、高通量检测的检测器件是实现超分子组装在荧光检测方面更为广泛应用的发展方向。

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