3－苯基－2－（4－叔丁基苯氧基）－3′－氧环己烷并噻吩并［2，3－d］嘧啶－4（3 H）－酮的合成及其与BSA的相互作用

周 亮，陈 静

（1．湖北科技学院药学院，湖北 咸宁437100；2．湖北科技学院核技术与化学生物学院，湖北 咸宁437100）

血清白蛋白是血浆中含量最丰富的重要载体蛋白。药物进入体内后都是通过与血清白蛋白的结合、运输到达受体部位而发挥药效的。因此，研究药物小分子与蛋白质的相互作用对于了解药物在体内如何储存、运输进而发生药理作用具有重要的意义［1－6］。

噻吩并嘧啶酮类化合物是一类具有良好生物活性和药理活性的杂环化合物，有些具有良好的抗滤过性病原体、抗惊厥、杀菌及除草等生物活性，还有些可以用作镇定剂［7，8］。作者合成了3－苯基－2－（4－叔丁基苯氧基）－3′－氧环己烷并噻吩并［2，3－d］嘧啶－4（3 H）－酮（PTP），并采用紫外吸收光谱法和荧光光谱法，在生理条件下研究了不同温度下PTP与牛血清白蛋白（BSA）的相互作用，考察了PTP对BSA构象的影响，为进一步研究PTP的药物作用机理及药物开发提供了重要信息。PTP的分子结构见图1。

图1 PTP的分子结构Fig．1 The molecular structure of PTP

1 实验

1．1 试剂与仪器

牛血清白蛋白（BSA，中国科学院化学研究所）溶解在Tris－HCl（0．05mol·L－1Tris＋0．10mol·L－1NaCl，pH＝7．4）缓冲溶液中，BSA溶液在实验前15 min配制；其它试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

BS124S型电子分析天平，北京赛多利斯；PHS－3C型pH计，江苏江分；UV－2300型紫外可见分光光度计、F－4500型荧光分光光度计（带恒温系统），日本日立。

1．2 PTP的合成

向干燥的50mL圆底烧瓶中加入1．461g（3mmol）膦亚胺，再加入约10mL四氢呋喃使其溶解，并快速加入等摩尔的芳基异氰酸酯，密闭于冰箱干燥器中静置8h或12h，所得碳二亚胺无需纯化，直接在搅拌下加入到溶有3mmol酚和一定量的固体碳酸钾的四氢呋喃溶液中，40～45℃下搅拌过夜，过滤，减压蒸去溶剂，残余物以乙醇和二氯甲烷重结晶，得到2－芳氧基吡喃并噻吩并嘧啶酮衍生物PTP。

1．3 荧光光谱测试

以DMF为溶剂配制浓度为5．0×103mol·L－1的PTP储备液以及不同温度（T＝298K、302K、306 K、310K）下pH＝7．4的Tris－HCl缓冲溶液。

在1cm的比色皿中加入2mL浓度为1×10－5mol·L－1的BSA溶液，以λ＝295nm激发，激发狭缝和发射狭缝均为5nm，测定荧光光谱。然后逐次加入2μL PTP，测定系列溶液在不同温度下300～500nm的荧光光谱。

2 结果与讨论

2．1 PTP的波谱数据

IR（KBr），ν，cm－1：1698（C＝O），1602（C＝N），1572、1556、1497、1444（C＝C），1260（C－N），1219（C－O－C）。

1HNMR（300MHz，CDCl3），δ：1．29（s，9H，3CH3）；3．08（2H，CH2）；4．00（s，2H，CH2）；4．76（s，2H，CH2）；7．05（m，9H，C6H5，C6H4）。

MS，m／z，%：432（60）［M＋］，346（17），283（29），257（38），253（59），227（100），181（58），119（41），77（31）。

2．2 荧光光谱分析

BSA分子中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基，因而具有内源性荧光。当激发波长为295nm时，BSA荧光发射峰位置在346nm附近；以同样激发波长激发5．0×103mol·L－1PTP溶液，在346nm附近没有荧光。这证明PTP不会产生与BSA相互干扰的荧光。298K下，保持BSA浓度不变、加入不同浓度的PTP，BSA的荧光光谱见图2。

图2 不同浓度PTP存在下BSA的荧光光谱Fig．2 The fluorescence spectra of BSA in the presence of different concentrations of PTP

从图2可以看出，随着PTP浓度的增大，BSA的内源性荧光强度有规律地降低，说明PTP能够猝灭BSA的荧光，两者之间存在着相互作用。

2．3 猝灭机理的推断

引起BSA荧光猝灭的机理通常为动态猝灭和静态猝灭两种类型。动态猝灭是猝灭剂分子与荧光物质的激发态之间发生能量转移或电子转移，生成瞬时的激发态复合物，从而引起荧光猝灭。动态猝灭常数会随着温度的升高而增大。其过程遵循Stern－Volmer方程［9］：

式中：F、F0分别为有、无猝灭剂时的荧光强度；Kq为双分子猝灭过程的速率常数；KSV为Stern－Volmer猝灭常数；τ0为猝灭剂不存在时生物大分子的平均寿命，约为10－8s；［Q］为猝灭剂浓度。通常各类荧光猝灭剂对生物大分子的最大动态猝灭速率常数为2．0×1010L·mol－1·s－1。

根据Stern－Volmer方程，绘制不同温度下（T＝298K、302K、306K 和310K）的［（F0／F）－1］～［Q］曲线，见图3。

图3 不同温度下PTP对BSA荧光猝灭的Stern－Volmer曲线Fig．3 Stern－Volmer plots for fluorescence quench of BSA by PTP at different temperatures

依据图3中猝灭曲线的斜率求得298K、302K、306K和310K时的荧光猝灭常数KSV分别为1．115×105L·mol－1、1．012×105L·mol－1、0．986×105L·mol－1、0．837×105L·mol－1。可以明显看出猝灭常数是随着温度的升高而减小的，表明PTP对BSA的荧光猝灭应为静态猝灭机理。进一步求得298K、302K、306K、310K下的猝灭速率常数Kq分别为1．115×1013L·mol－1·s－1、1．012×1013L·mol－1·s－1、0．986×1013L·mol－1·s－1、0．837×1013L·mol－1·s－1。均远远大于2．0×1010L·mol－1·s－1，再次说明引起BSA溶液体系荧光猝灭的主要原因是静态猝灭。

2．4 作用力类型的确定

PTP与BSA的静态猝灭作用可以用Lineweaver－Burk双倒数函数方程进行描述：

式中：KLB为静态荧光猝灭的结合常数，用来描述静态猝灭过程中猝灭剂与生物大分子的结合反应达到平衡时的量效关系。

绘制（F0－F）－1～［Q］－1曲线，依据其斜率和截距求出KLB的值，并进一步求出热力学参数ΔHθ、ΔGθ、ΔSθ，见表1。

表1 不同温度下PTP与BSA相互作用的Lineweaver－Burk线性回归方程、结合常数KLB、热力学参数Tab．1 Binding constant KLB，Lineweaver－Burk linear regression equation and thermodynamic parametersfor interaction between PTP and BSA at different temperatures

在静态猝灭过程中，静态猝灭荧光强度与猝灭剂之间的关系可由荧光－猝灭剂分子间的表观结合常数表达式导出［8］：

式中：Ka为猝灭剂与BSA之间的表观结合常数；n为结合位点数。

从表1可以看出，KLB的数值较大，表明PTP和BSA之间存在着较强的相互作用，且KLB随着温度的升高而减小。

根据反应前后热力学焓变ΔHθ和熵变ΔSθ的相对大小，可以判断药物分子与蛋白质之间的主要作用力类型：ΔHθ＜0、ΔSθ＜0时，为范德华力和氢键；ΔHθ≈0、ΔSθ＞0时，为静电引力；ΔHθ＞0、ΔSθ＞0时，为疏水作用力。从表1可以看出，PTP与BSA的相互作用是自发的（ΔGθ＜0），且ΔHθ＜0、ΔSθ＜0，可以认为PTP与BSA之间的作用力主要是范德华力和氢键［10］。

2．5 表观结合常数及结合位点数的计算

表2 不同温度下的表观结合常数Ka和结合位点数Tab．2 Binding constant Kaand the number of binding site at different temperatures

从表2可以看出，在不同温度下（pH＝7．4），PTP与BSA的结合位点数n均接近1，说明PTP与BSA形成1个结合位点；Ka随着温度的升高逐渐增大，说明PTP与BSA形成了比较稳定的终合物［11］。

2．6 结合距离的计算

根据Fster的无辐射能量转移理论，能量转移效率E与供体－受体间距离r、临界能量转移距离R0之间有如下关系式［12］：

式中：R0为转移效率为50%时的临界距离。R0可由下式求出：

式中：K2为偶极空间取向因子；n为介质的折射指数；Φ为供体的荧光量子产率；J为供体的荧光发射光谱与受体吸收光谱的光谱重叠积分，即：

式中：F（λ）为荧光受体在波长λ处的荧光强度；ε（λ）为受体在波长λ处的摩尔吸光系数。

PTP与BSA的摩尔比为1∶1时，PTP的紫外吸收光谱与BSA荧光光谱的重叠见图4。

图4 PTP吸收光谱（a）与BSA荧光光谱（b）的重叠Fig．4 Overlap of PTP absorption spectrum（a）and BSA fluorescence spectrum（b）

依据图4中的光谱重叠部分按式（6）求出J。在上述条件下，取向因子取供体－受体各项随机分布的平均值，即K2＝2／3；折射指数取水和有机物的平均值，即n＝1．36；BSA中色氨酸残基的荧光量子产率Ф＝0．15；通过计算机辅助计算，求得PTP与BSA内氨基酸残基分子间的距离r＝1．78nm，符合能量转移理论。这就表明PTP与BSA是足够靠近的（r＜8nm），两者之间是通过非辐射能量转移的结合。

2．7 PTP对BSA构象的影响

采用同步荧光光谱法，固定BSA的浓度、逐渐增大PTP的浓度，记录Δλex＝15nm和Δλex＝60nm 时的同步荧光光谱。结果发现，酪氨酸残基和色氨酸残基的最大发射波长基本不变，说明PTP的加入并未使BSA的构象发生明显的改变。

3 结论

通过Aza－Wittig反应，碳二亚胺与酚类化合物在碱性催化条件下成环，合成3－苯基－2－（4－叔丁基苯氧基）－3′－氧环 己 烷 并 噻 吩 并 ［2，3－d］嘧 啶 －4（3 H）－酮（PTP）。采用紫外吸收光谱法、荧光光谱法研究了PTP与BSA之间的相互作用，并考察了PTP的加入对BSA构象的影响。结果表明，PTP对BSA的荧光猝灭机理为静态猝灭过程，PTP与BSA的结合反应为自发进行，反应中主要作用力是氢键和范德华力，两者的结合位点数为1、结合距离为1．78nm，PTP的加入对BSA构象没有明显影响。对进一步探索PTP在医学上的应用有着重要参考价值。

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