易更新磁性碳纳米管修饰电极对白蛋白的测定

于巧玲，李建平

(1.桂林理工大学化学与生物工程学院，广西 桂林 541004；2.柳州职业技术学院环境与食品工程系，广西 柳州 545006)

蛋白质是维持生命活动的重要物质。血清中白蛋白浓度的降低是低蛋白血症和营养失调的典型症状；血清或尿液中的白蛋白浓度变化与 慢性肝功能障碍、糖尿病性肾病息息相关，也是胰岛素依赖型糖尿病的可能诱因[1]。最新研究表明，粪便中血红蛋白和白蛋白可以用于非侵入式筛查大肠癌[2]。因此，血清白蛋白的检测对于生命科学、临床医学都有重要意义。白蛋白的检测尚未有全球化的标准方法，电化学传感器具有高灵敏度、低检出限的优点[3]，是常用的蛋白质检测方法。然而，作为核心部件的修饰电极在电化学分析的过程中，缔合、杂交等反应通常在电极表面发生，使得电极表面更新困难，重复使用使得测定的精密度和重现性变差，而整个电极的重复制作又不经济。因此，制作能多次使用的修饰电极是电化学分析的重要研究内容。

磁性纳米粒子可以在非接触性的磁力作用下，与其它物体结合；磁力消失后又瞬间分离，具有更新方便的特点，是理想的可更新修饰电极原料。本文将磁性纳米粒子结合在电化学性能和吸附性能优良的碳纳米管（CNTs）上，制成了更新方便、实用的磁性碳纳米管修饰电极，成功实现了皮克级牛白蛋白（BA）的测定，检出限为1.2pg·mL-1。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

日本岛津H600 型透射电镜；CHI 66 0B 电化学工作站，使用三电极体系，即参比电极为饱和Ag/AgCl 电极，对电极为铂丝电极，工作电极为自制的磁性CNTs 修饰电极。

BA，配好的水溶液在4℃的冰箱内保存，2d 内使用；CNTs，多壁碳纳米管，外径10nm，纯度＞95%；其余无机试剂均为国产分析纯，实验用水为蒸馏水。

1.2 磁性CNTs 的制备与负载

本文参考了文献[4]中有关磁性纳米粒子的合成，并做了适当调整使磁性纳米粒子Fe3O4牢固结合在CNTs 上。具体实验方法为：称取1g CNTs 置入25mL 的FeCl3（0.5mol·L-1）溶液中，超声60min；在搅拌条件下，分别滴入14.3mL FeSO4（0.5mol·L-1）和3.5mL 浓氨水,搅拌15min 后,继续缓慢滴入1.5mL 浓氨水,继续搅拌30min 后，置于80℃恒温水浴中反应30min。然后将合成的磁性CNTs 在磁力的约束下反复冲洗至中性、干燥，制成了磁性CNTs 纳米粒子。

取0.2g 制备好的磁性CNTs，置于0.5mmol·L-1ARS 水溶液中震荡吸附8h。反复冲洗后转移至25mL 容量瓶中，定容，得到负载ARS 的磁性CNTs的悬浊液。

1.3 磁性CNTs 修饰电极的制做

在玻璃管内依次封装玻碳片、弹簧，铁棒；为了保证良好的导电性，石墨糊填充在铁棒与玻碳之间；电极尾端用塑料圆片粘胶密封，就制成了玻碳裸电极。对该电极进行物理性抛光，然后依次置于（1∶1）HNO3、无水乙醇中超声清洗5min，冲洗干燥后，将5μL 负载ARS 的磁性CNTs 纳米粒子悬浊液滴到玻碳裸电极上，在永久性白磁铁的作用下，这些纳米就牢牢附着在玻碳裸电极上制成磁性CNTs 修饰电极，即得工作电极(图1)。

图1 碳纳米管磁性修饰电极示意图

1.4 测定方法

在10mL 容量瓶中加入0.7mL H2SO4（0.2mol·L-1），一定量的BA 标准溶液,用0.2 mol·L-1的KCl 定容，然后全部转移至烧杯中，静置100s，使BA 与电极表面的ARS 反应。在-0.1～-0.45V 间，扫描速度为0.1V·s-1条件下，记录稳定后的循环伏安曲线,测量前后电流变化值。磁性修饰电极每次使用后，弃去磁性CNTs纳米粒子，抛光清洗玻碳裸电极。

2 结果与讨论

2.1 磁性CNTs 纳米粒子的表征

磁性CNTs 纳米粒子形貌采用日本岛津H600型透射电镜进行分析，结果如图2 所示。可以看出，CNTs 上沉积有较多的球形Fe3O4纳米粒子，这些磁性粒子结合在CNTs 的外壁上，粒径分布集中在15～25nm 之间，其尺寸与形状与文献报道一致[4]。显然，采用本文上述的实验方法，可以在CNTs 外表面结合具有磁性的Fe3O4纳米粒子，从而实现磁性CNTs 纳米粒子的制备。

图2 磁性CNTs 纳米粒子的透射电镜图

2.2 磁性CNTs 修饰电极的伏安特性

考察了磁性CNTs 修饰电极在0.14mol·L-1H2SO4-0.2mol·L-1KCl 介质以及加有BA 溶液中的循环伏安特性，结果见图3。可以看出，玻碳裸电极背景低，没有任何氧化还原峰（图3c）；修饰成磁性CNTs 修饰电极后，修饰电极中的ABS 直接发生氧化还原反应，形成明显的氧化还原电流（图3a），说明该磁性CNTs 修饰电极电子传导性能良好，ARS的峰形稍差主要是由于ARS分子内大π键中的π-π电子与CNTs 内碳原子的sp2杂化形成的六元环相互重叠成键，影响到电化学氧化还原过程，使得ARS峰形变差；随着BA 的加入，BA 逐步与ARS 反应，ARS 的峰电流变小、峰形却逐渐变好（图3b）。BA由3个圆筒状的包埋有疏水性氨基酸残基的疏水性空腔[5]组成，电极反应时，ARS 分子嵌入BA 疏水性空腔形成非电活性的超分子化合物导致峰电流变小，同时ARS 也远离碳元素的π 电子，峰形变好。图3 充分说明磁性CNTs 修饰电极具有良好的电化学性能，对BA 响应明显，适合BA 测试使用。

图3 循环伏安图

2.3 测试底液的优化选择

分别以硼砂缓冲液、Tris-HCl、NH3.H2O-NH4Cl、HAc-NaAc、磷酸盐缓冲液、盐酸、硫酸等溶液作为底液进行pH 的优化选择。结果表明，在硫酸介质中ARS 循环伏安图的峰形最好，峰电流最大。改变硫酸溶液的pH 进一步考察，当pH ≤2 时，ARS氧化和还原过程都能得到良好的峰形，主要是因为此时的ARS 以分子内氢键的形式存在[6]；当pH ＞2 时，峰形开始变差，这可能是由于此pH 条件下的ARS 是以一级电离和二级电离结构存在,电活性差的原因引起的。因此本文选取0.14mol·L-1硫酸-0.2mol·L-1KCl 作为底液。

2.4 峰电流与扫速的关系

在BA 溶液中，将负载ARS 的磁性CNTs 修饰电极以不同扫速进行循环伏安扫描，结果见图4。由图4 可见，循环伏安图峰型很好，是一个可逆的电化学过程，并且阴阳两极的峰电流都与扫速v成正比，说明整个电极过程受吸附控制，而CNTs 的吸附性能优良，有利于降低测定的检出限。

图4 扫速对峰电流的影响

2.5 磁性CNTs 修饰电极对BA 的测定

磁性CNTs 修饰电极在扫速为0.1V·s-1，E=-0.45V 条件下对BA 标准溶液进行测定，并绘制了标准曲线，BA 的浓度与峰电流成反比，随着BA 浓度的增大，峰电流逐渐变小，当浓度大于150pg 后，峰电流值出现平台，与BA 浓度不相关。线性回归方程 为i（mA）＝-36.25C（pg·mL-1）+0.78262,相关系数r=0.9994，检出限为1.2pg·mL-1，线性范围为4～150pg·mL-1。可见该磁性CNTs 修饰电极对BA 的测定灵敏度高、检出限低。

2.6 电极反应速率常数的测定

依据Laviron 理论[7],还原峰电位遵循以下关系式:

其中,Ep为还原峰电位，单位为V；E0为电极反应的克式电位，单位为V；k0为电极反应速率常数，单位为s-1；α 为电子转移系数；n为反应电子数；F 为法拉第常数,单位为C·mol-1；R 为气体常数，以J·mol-1·K-1为单位；T为绝对温度，K；v为扫描速度，V·s-1。

由式1 可知,还原峰电位Ep与lnv有线性关系(图5)。作Ep和v关系图（图6）,E0由Ep外推在y 轴上的截距求出，E0=-0.2742 V。由图5 中斜率=-0.0664 可以算出α=0.19,从截距为-0.3526可以求出k0=4.6s-1。

图5 还原峰电位与扫速对数的关系图

图6 还原峰电位与扫速的关系图

3 结论

在CNTs 上合成纳米级Fe3O4，吸附ARS 后，吸到玻碳裸电极表面制成了更新方便的磁性CNTs 修饰电极，成功实现了皮克级BA 的测定。CNTs 吸附性能超强使得检出限降低，磁性颗粒更新方便。二者的结合，使得测定方法简便，灵敏度高，检出限低，更新方便，具有很强的实用价值。

[1]Monte W C，Johnston C S，Roll L E.Bovine serum albumin detected in infant formula is possible trigger for insulindependent diabetes mellitus[J].J Am Diet Assoc，1994,94（3）：314-316.

[2]Tarpay A，Nemeth M S，Orosz E，et al.A double immunochemical method for detecting faecal haemoglobin and albumin in rectal screening[J].Magyar onkologia，2011,55（4）：268-273.

[3]Rusling J F.Nanomaterials-based electrochemical immunosensors for proteins[J].Chem Rec，2012,12（1）：164-176.

[4]于巧玲，李建平.负载茜素红S 的纳米磁性碳粉修饰电极测定牛白蛋白[J].分析化学，2006，34（2）：247-250.

[5]高道江，王建华.超微磁性Fe3O4粒子的制备[J].四川师范大学学报：自然科学版，1997，20（6）：94-97.

[6]朱永春，董绍俊.光谱电化学方法研究—茜素红S 在玻碳电极上的电化学行为[J].化学学报，1990，48（6）：534-539.

[7]Laviron E.General expression of the linear potential sweep voltammogram in the case of diffusionless electrochemical systems[J].J Electroanal Chem and Interfacial Electrochemistry，1979,101（1）：19-28.