印迹基因H19对人绒毛膜上皮癌细胞JEG－3基因表达谱的影响＊

俞丽丽，李 力△，赵 丹，卢林杉，郑英如，陈星云，李 平，周元国

（第三军医大学大坪医院野战外科研究所：1.妇产科；2.第七研究室，重庆 400042）

基因印迹是一种不遵从经典的孟德尔遗传规律的依靠单亲传递某些遗传学性状的现象，目前已成为遗传学领域的研究热点。其中H19作为发现最早的印迹基因之一，主要在人胎盘及胚胎组织中丰富表达，在成人组织中很少表达。而且有证据表明，H19在配子形成、胚胎的早期形成、着床以及生长发育过程中发挥了重要的生理功能，并与肿瘤的发生密切相关［1］。但H19的作用机制目前仍未能完全阐明。因此，本研究利用国际常用的人滋养层细胞模型－－人绒毛膜上皮癌细胞系（JEG－3）作为体外实验模型，通过基因工程技术来深入探讨H19对滋养细胞基因表达谱的影响，以期阐明H19对滋养细胞生物学行为的调控机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒 包含人全长H19cDNA重组真核表达质粒pRc／CMV由蒙特利尔大学医院内分泌科Cheri.L.Deal教授惠赠。空载质粒pRC／CMV购自invitrogen公司。

1.1.2 细胞系 JEG－3细胞，为人滋养细胞肿瘤株，由第四军医大学唐都医院妇产科实验室惠赠，购买于美国ATCC细胞库。

1.1.3 主要试剂及仪器 DMEM／F12基础培养基和胎牛血清，质粒小量提取试剂盒（OMEGA），质粒去内毒素纯化试剂盒 D6944－1，Trizol、脂质体转染试剂盒（Lipofectamine 2000），定量PCR试剂（ABI Power SYBR Green PCR Master Mix），定量PCR仪（7000Sequence Detection System）。H19基因和GAPDH基因上、下游引物均由上海英俊生物技术有限公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 JEG－3细胞的培养 冻存于液氮的JEG－3细胞经复苏后，于37℃5%CO2条件下培养于含10%胎牛血清的DMEM／F12培养液中，经3次传代稳定后，进行基因转染。

表1 验证基因PCR引物序列

1.2.2 质粒的纯化及鉴定 重组H19真核表达质粒pRc／CMV－H19质粒，先用OMEGA质粒小提试剂盒抽提后送invitrogen公司测序。测序结果经BLAST确证后pRc／CMVH19质粒和空载质粒pRc／CMV按QIAGEN试剂盒手册操作大量抽提。

1.2.3 基因转染和鉴定 以pRc／CMV－H19质粒转染JEG－3细胞，按Lipofectamine 2000手册操作，并以空载质粒pRc／CMV转染JEG－3细胞为pRc／CMV转染阴性对照，以仅加Lipofectamine 2000的JEG－3细胞为空白对照。实验组和对照组在转染后24h收集细胞，采用Trizol一步法提取总RNA，逆转录后荧光定量PCR分析H19基因表达变化。H19基因上游引物：5′－TCC CAG AAC CCA CAA CAT GAA－3′，下游引物：5′－TTC ACC TTC CAG AGC CGA TTC－3′（150bp），GAPDH 基因上游引物：5′－TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA－3′，下游引物：5′－CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA－3′。SYBR Green RT－PCR反应条件：50℃孵育2min，95℃2 min，95℃15s，59℃1min，40个循环。

1.2.4 芯片检测 3组细胞采用Trizol一步法提取总RNA，经纯化后合成cDNA和生物素标记cDNA，采用Affymetrix公司生产的U133plus 2.0Array基因表达谱芯片，在Affymetrix Genechip Hybridization Oven640中杂交后，在 Affymetrix Fluidics Station 450中洗脱和染色，芯片结果采用Gene array Scanner30007G进行扫描。GCOS软件读取、处理数据。差异基因筛选标准为实验组和对照组比值取Log2后的值即Signal Log Ratio≥1（上调）或≤－1（下调）。

1.3 荧光定量PCR验证芯片结果 分别选取芯片结果中已知的差异基因（EPS15、DUSP5、HES1）和非差异基因（IGF2、MMP－9），采用SYBER Green荧光定量PCR方法检测3组细胞中相关基因的mRNA的表达，验证两种方法是否一致。各检测基因引物序列见表1。

1.4 荧光定量PCR检测差异基因HES1（hairy enhancer of split 1）的表达水平 采用Trizol一步法提取重度子痫前期胎盘组织与正常晚孕胎盘组织总RNA，逆转录合成cDNA，采用SYBER Green荧光定量PCR方法检测RNA的表达水平。

1.5 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，计量资料用表示，采用单因素方差分析检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 pRc／CMV－H19质粒的测序结果 测序结果与Gene－Bank上的序列进行BLAST，结果完全正确。

2.2 各组细胞H19基因的表达 荧光定量PCR的检测结果显示pRc／CMV－H19质粒转染组、pRc／CMV转染阴性对照组和空白对照组的ΔCT分别为－0.8594、4.2975、3.4284。pRc／CMV－H19质粒转染组H19mRNA水平相对于pRc／CMV转染阴性对照组和空白对照组高16倍以上，而pRc／CMV转染阴性对照组和空白对照组H19mRNA水平无差异。该检测结果与后期芯片的检测结果是一致的。

2.3 芯片检测结果 通过采用Affymetri：U133plus 2.0Array基因表达谱芯片共检测了三张芯片，检测工作均由上海生物芯片有限公司（生物芯片上海国家工程研究中心）完成，有严格的样本质检报告以及质控标准。结果发现pRc／CMV－H19质粒转染组细胞与空白对照组细胞相比，共有491条上调基因，664条下调基因；pRc／CMV－H19质粒转染组细胞与pRc／CMV转染阴性对照组细胞相比，共有82条上调基因，220条下调基因；pRc／CMV转染阴性对照组细胞与空白对照组细胞相比，共有409条上调基因，314条下调基因。为了获得印迹基因H19对JEG－3细胞基因表达谱的影响，进一步优化筛选标准：pRc／CMV－H19质粒转染组细胞与两对照组细胞相同的差异基因，但必须是两对照组之间的非差异基因。结果发现共有96条差异基因，其中上调基因19条，下调基因77条。见表2。

2.4 荧光定量PCR 检测H19过表达对IGF2、HES1、EPS15、DUSP5、MMP－9基因mRNA的影响以验证芯片数据的可靠性：除EPS15外其余基因荧光定量PCR结果与芯片相符。采用2－△△CT法计算各组目的基因相对于阴性对照组目的基因的相对表达水平，ΔΔCT＝各样品ΔCt－阴性对照组ΔCt平均值。荧光定量PCR的检测结果显示H19质粒转染后HES1、DUSP5mRNA表达较阴性对照组明显下调，而EPS15、IGF2、MMP－9mRNA表达则无明显改变。H19质粒转染组HES1和DUSP5mRNA相对于阴性对照组的表达倍数分别是0.44±0.07、0.38±0.02，与阴性对照组比较，P＜0.01。即H19过表达后HES1和DUSP5mRNA表达水平分别被抑制了56%和62%，而EPS15、IGF2mRNA和 MMP－9基因表达水平与阴性对照组比较，差异无统计学意义。空白对照组HES1、DUSP5、IGF2和 MMP－9mRNA表达相对于阴性对照组的表达倍数分别是3.16±1.13、3.89±0.08、1.95±0.37和0.15±0.02，而EPS15mRNA表达则无明显改变。见图1。实验结果显示除EPS15外其余基因荧光定量PCR结果与芯片相符。

表2 差异基因的基因分类

图1 H19过表达对EPS15、DUSP5、HES1、IGF2、MMP－9基因mRNA表达的影响

2.5 重度子痫前期胎盘组织与正常晚孕胎盘组织HES1mRNA表达水平 重度子痫前期胎盘组织HES1mRNA相对表达倍数为0.14±0.05，正常晚孕胎盘组织HES1mRNA相对表达倍数为0.49±0.27。两者比较，重度子痫前期胎盘组织HES1mRNA的表达水平较正常晚孕胎盘组织中HES1mRNA的表达水平明显降低（P＜0.01）。

3 讨 论

正常的基因印迹在功能上与胎儿及胎盘的发育、细胞分化和增殖等有关［2］。基因印迹异常（如印迹丢失、杂合性丢失、单亲二倍体等现象）与某些特殊的遗传性疾病及肿瘤的发生密切相关［3］。人H19是一种母方表达、父方沉默的印迹基因，定位于染色体11p15.5区，全长约3kb，共含有5个外显子、4个内含子。目前公认H19不能产生蛋白质，其最终表达产物是RNA，并在RNA水平发挥作用。但H19的作用机制目前仍未能完全阐明。有学者认为它是原癌基因［4］，也有学者认为它是抑癌基因，因此有人认为H19在细胞的增殖、分化和侵袭方面具有双重作用［5］。本研究以人滋养细胞肿瘤细胞系JEG－3为体外实验模型，通过含人全长H19cDNA重组真核表达质粒转染JEG－3后，结果发现3组之间的细胞基因表达谱均存在的明显差异。作者运用生物信息学方法进一步优化筛选标准：pRc／CMV－H19质粒转染组细胞与两对照组细胞均存在差异的基因，但这些基因必须是两对照组之间的非差异基因。结果发现共有96条差异基因，其中上调基因19条，下调基因77条。这些基因共有30条为未知功能基因，66条已知功能基因主要与转录调控、受体结合、细胞代谢、细胞发育、细胞进程和生物学调节功能相关。

胰岛素样生长因子－2（IGF2）作为与H19互为连锁的印迹基因，位于同一条染色体上，也是人类基因组中最早被鉴定的印迹基因之一，在大部分组织中呈父系表达，母系印迹。有文献报道H19可调控IGF2的表达，H19基因的缺失，将导致IGF2基因母系等位基因表达［6－8］。之后越来越多的研究结果发现H19、IGF2的表达水平和印迹状态之间，H19与IGF2之间并未存在固定的联系［9－10］。本研究前期发现H19过表达不引起IGF2的表达变化；同样采用RNA干扰的方法来观察H19对IGF2表达的影响也发现在滋养细胞中H19与IGF2之间不存在固定的联系［11］。

HES1属于HES基因家族，而HES基因家族又属于抑制型bHLH（basic helix－loop－helix）基因。HES基因编码的蛋白为碱性螺旋－环－螺旋结合蛋白，是一类含有特征性碱性螺旋－环－螺旋结构（bHLH）的DNA结合蛋白，在进化过程中高度保守，可通过bHLH区域直接与靶DNA或与其他bHLH蛋白结合形成无活性二聚体阻断激活路径而抑制转录，最终抑制干细胞分化而影响细胞命运。HES1基因敲除的小鼠神经细胞在前体细胞增殖前就过早分化，结果导致神经系统严重发育异常，如无脑畸形、眼形成异常等，在胚胎发育晚期或出生后不久即死亡［12－13］。Kunnimalaiyaan等［14］通过将HES1基因稳定地导入H727类癌瘤细胞，使其稳定表达，发现可以抑制类癌瘤细胞的增殖。Liu等［15］研究发现在宫颈上皮内瘤变及宫颈癌中HES1表达增强，并随着病变加重表达逐渐增强。

在正常胎盘滋养细胞以及滋养细胞肿瘤组织中均未见HES1的研究报道，也无印迹基因H19与HES1之间关系的研究报道。经芯片检测的结果提示，通过定量PCR方法检测了H19的过表达可下调JEG－3细胞HES1的表达。进一步研究表明重度子痫前期胎盘组织中HES1mRNA表达水平下调，提示HES1表达受阻时，滋养细胞的分化障碍导致滋养细胞功能异常，从而参与子痫前期的发病。

总之，本次芯片实验结果表明印迹基因H19主要可引起转录调控、受体结合、细胞代谢、细胞发育、细胞进程和生物学调节相关基因的改变，从而调节滋养细胞的生物学功能，对未知功能基因的深入研究将有助于进一步了解H19对滋养细胞的调控机制。

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