鸡新城疫病毒分离鉴定及其部分生物学特性的研究

郭利英

（内蒙古乌兰察布职业学院新校区生物技术系，内蒙古乌兰察布012000）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的以感染禽类为主的一种急性、高度接触性传染病，是威胁养禽业的主要疾病之一［1-2］。新城疫呈世界性流行，各国都十分重视该病，经过几十年的努力，世界各国基本将该病控制住，但从近些年的调查研究中可以看到，我国的新城疫大规模流行已得到基本控制，但新城疫仍未从根本上杜绝，在部分地区仍时常散发，而且症状与病变呈非典型性［3］，有的病程呈慢性经过，给养殖业带来很大损失［4］，分析其可能原因之一是与强毒不断从外界引入有关。已有研究表明，许多禽类如鸽［5］、麻雀［6］等对NDV也有易感性，可以作为保毒宿主甚至作为传染源，它们在一定范围内的活动可以将疫区的NDV强毒引入鸡群，使鸡场不断受到野外强毒威胁。我国是一个养鸡大国，养鸡在农村甚为普遍，是农民一项重要经济来源，但是由于交通、技术等原因，长期以来这些地区成为免疫薄弱区，特别在偏远村落，往往不按合理的免疫程序和免疫方法操作，甚至不用疫苗免疫接种，这样的鸡群一旦侵入强毒则呈典型暴发，造成极大的损失［7］。因此，本研究的目的就是了解近年来内蒙古乌兰察布地区新城疫的流行现状，研究流行毒株的常规生物学特性，分析该病的流行趋势，为新城疫有效诊断和控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 病料采自内蒙古集宁地区2个养鸡场中病死鸡的肝脏、肺脏、脾脏、肾脏等组织。

1.1.2 参考毒株及阳性血清 NDV标准强毒株F48E9和弱毒株La Sota，由内蒙古农业大学兽医学院预防兽医学教研室传染病组保存；NDV阳性血清和禽流感病毒（AIV）阳性血清（H5N1），由内蒙古农业大学兽医学院预防兽医学教研室传染病组提供。

1.1.3 实验动物 SPF种蛋由天津瑞普生物制药厂提供，9日龄～10日龄SPF鸡胚，用SPF种蛋在实验室内用消毒好的孵化器孵化。1日龄SPF雏鸡，用SPF种蛋在实验室内用消毒好的孵化器孵化分组饲养于消毒的动物房内。6周龄鸡，用SPF种蛋在实验室内用消毒好的孵化器孵化，非新城疫疫苗免疫，分组饲养于消毒的动物房内。健康马、牛、羊、鸡、兔红细胞由内蒙古农业大学实验动物院提供。人O型新鲜血液由内蒙古中心血站提供。

1.2 方法

1.2.1 病料的处理 分别取不同鸡场病死鸡的脑组织放入消毒好的试管中，用吸管或玻璃棒研磨后加入灭菌生理盐水配成1∶10组织混悬液，经过3次冻融，离心10min（2 000r／min～3 000r／min），之后取上清液加青霉素、链霉素使其浓度为1 000单位／mL，4℃过夜后置-20℃保存。

1.2.2 鸡胚接种传代 取9日龄～11日龄SPF鸡胚，用1mL注射器吸取处理好的病料接种9日龄～11日龄SPF鸡胚（0.1mL／枚），用石蜡封闭接种孔。同时以3枚鸡胚接种0.1mL／枚灭菌生理盐水作对照，然后于37℃的恒温箱内孵育，将24h内的死胚弃去，24h～96h的死胚及96h存活胚置4℃过夜后观察鸡胚病变，同时无菌采集尿囊液，-20℃保存。

1.2.3 血凝和血凝抑制试验 按常规微量法（25μL）［4］测定无菌收集尿囊液的血凝价，再用 NDV阳性血清和AIV阳性血清进行血凝抑制试验。

1.2.4 血清中和试验 将2个分离株第3代的鸡胚尿囊液分别用灭菌生理盐水稀释1 000倍，各取1 mL病毒稀释液分别与等量10倍稀释的新城疫标准阳性血清和AIV标准阳性血清充分混均后于37℃作用1h，同时设置上述灭菌生理盐水稀释1 000倍尿囊液作为对照组，每组接种10日龄鸡胚5只，每胚0.1mL，37℃孵育，接种后每天照蛋2次～4次，死胚随时拿出，连续照蛋7d，活胚置于4℃冰箱冻死测定所有鸡胚尿囊液的血凝价。

1.2.5 红细胞凝集谱的测定 分别取鸡、牛、羊、兔、马及人O型新鲜血液配置成10mL／L的红细胞，对不同鸡场分离的NDV毒株和弱毒株La Sota尿囊液做血凝试验，测定各毒株对不同动物红细胞的凝集力。

1.2.6 毒株毒力测定

1.2.6.1 致死鸡胚平均死亡时间（MDT）的测定

JN1和JN2株NDV鸡胚尿囊液用无菌生理盐水（含青霉素和链霉素）按10倍系列稀释，每个稀释度分别接种10日龄的SPF 8枚（0.1mL／枚）。37℃孵化，弃去24h内死胚，每天照蛋4次，连续观察7 d。同时设灭菌生理盐水接种作正常对照。观察鸡胚死亡情况，剖检死亡鸡胚，最后按公式计算出致死鸡胚平均死亡时间（MDT）［8］。

1.2.6.2 对1日龄易感雏鸡脑内接种致病指数（ICPI）的测定 参照文献［9］，JN1和JN2株 NDV的鸡胚尿囊液用无菌生理盐水进行10-1稀释，给10只出壳后36h内的雏鸡进行脑内接种，同时以6只雏鸡脑内接种无菌生理盐水（含青霉素和链霉素）作对照，0.05mL／只，隔离饲养。每隔24h观察并记录鸡群的情况，进行评定，死鸡按2分记，发病鸡按1分记，正常鸡按0分记，连续进行8d观察。最后按公式求出ICPI。

1.2.6.3 对6周龄非免疫雏鸡静脉接种致病指数（IVPI）的测定 JN1和JN2株NDV鸡胚尿囊液用灭菌生理盐水作10-1稀释，每个毒株分别给10只6周龄非免疫雏鸡（0.1mL／只）翅静脉接种，并取4只，每只接种0.1mL灭菌生理盐水，作为正常对照组，隔离饲养。接种后，每隔24h对鸡群健康情况进行检查，连续观察10d，根据每日鸡群的健康情况记分，正常鸡只按0分记，发病鸡只按1分记，麻痹鸡只按2分记，死亡鸡只按3分记，设置对照鸡5只。按公式计算IVPI。

2 结果

2.1 毒株的分离和血凝试验结果

病料接种鸡胚后鸡胚大多在26h～78h死亡，死亡鸡胚尿囊液较清亮，全身都有出血现象，头、颈、腹部以及爪最严重，HA滴度为1∶16～1∶528。初代培养物盲传2代后鸡胚死亡时间逐渐规律，血凝价上升2个滴度。分离株分别命名为JN1和JN2。分离株接种鸡胚后鸡胚死亡情况及HA测定结果如表1。

表1 分离株接种鸡胚后鸡胚死亡情况及HA测定结果Table 1 The chicken embryo death and HA assay results of isolates after inoculation

2.2 血凝抑制试验结果

分离株尿囊液均可凝集SPF鸡的红细胞，初代培养物HA滴度为1∶16～1∶528，盲传2代后，血凝价可上升2个滴度。HA价在1∶32～1∶1 024，2个分离株可被NDV标准强毒株阳性血清所抑制，不被AIV阳性血清所抑制，分离株HI试验结果如表2。

2.3 血清中和试验结果

接种NDV标准阳性血清中和组的鸡胚全部健活，且鸡胚尿囊液无血凝性，而AIV阳性血清中和组和生理盐水稀释的1 000倍尿囊液作为对照组接种的鸡胚全部死亡，其死亡鸡胚尿囊液均有血凝性。

2.4 红细胞凝集谱的测定结果

分离毒株对不同动物红细胞的凝集作用不一样，两个分离毒株对马、牛、羊、兔红细胞的凝集价较低，而对鸡及人O型红细胞的凝集价较高。分离毒株对不同动物红细胞的凝集谱测定结果见表3。

2.5 分离毒株毒力测定结果

2.5.1 MDT测定的结果 2株NDV全部致死鸡胚的最高稀释度分别为10-7和10-7。对鸡胚进行观察，死亡鸡胚全身有明显的出血，其中头及四肢较严重，未死亡的鸡胚部分有出血现象，但不太明显。对照组8只鸡胚都正常。JN1和JN2的MDT结果分别为40.5h和43.5h。

2.5.2 ICPI测定结果 2株毒株接种后雏鸡表现的症状相似，主要为食欲下降，嗜睡，翅垂地，后期出现废食，跛行，一肢或两肢麻痹瘫痪，呼吸困难，甩头扭脖子，2d～3d后出现死亡，剖检后直肠后端有大量的水样粪便及白色尿酸盐，有的出现腺胃溃疡，肺水肿，脑内化脓，并有少量的炎性渗出物。JN1和JN2的ICPI结果分别为1.86和1.85。

2.5.3 IVPI测定结果 2株毒株接种后症状表现相似，主要为精神萎顿，打堆，嗜睡，有的咳嗽，气喘，粪便稀软发白，食欲减退，耷拉翅膀，部分有转圈运动，后期表现食欲废绝，鸡冠和肉髯发紫，张口呼吸，发出“呼噜”声，有扭头动作，部分口流黏液。2d～3 d出现死亡，剖检可见个别胆囊充盈，脾脏有白色小点状坏死灶，腺胃黏膜乳头常有大小不一的出血点，小肠、大肠的黏膜充血或出血，盲肠扁桃体肿大、出血和坏死，喉头有出血点等。JN1和JN2的IVPI结果分别为2.38和2.69。

表2 分离株HI试验结果Table 2 HI test results of isolates strains

表3 分离毒株红细胞凝集谱Table 3 The erythrocyte agglutination spectrum of isolate strains

3 讨论

从发病地区毒株的分离和血凝试验结果上看，分离株JN1和JN2尿囊液均可凝集SPF鸡的红细胞，初代培养物HA滴度为1∶16～1∶528。盲传2代后，血凝价可上升2个滴度。HA价在1∶32～1∶1 024。2个分离株可被NDV标准强毒株阳性血清所抑制，不被AIV阳性血清所抑制。接种NDV标准阳性血清中和组的鸡胚全部健活，且鸡胚尿囊液无血凝性，而AIV阳性血清中和组和生理盐水稀释的1 000倍尿囊液作为对照组接种的鸡胚全部死亡，其死亡鸡胚尿囊液均有血凝性。说明分离的病毒为新城疫病毒而且感染鸡胚血凝价很高。分离毒株对不同动物红细胞的凝集作用不一样，2个分离毒株对马、牛、羊、兔红细胞的凝集价较低，而对鸡及人O型红细胞的凝集价较高。这与孙静等［10］结果一样。薛俊龙［11］报道新城疫病毒一般对马和猪的红细胞不凝集，但有个别弱毒株可以凝集马的红细胞。

有资料报道，衡量NDV毒力强弱的常用方法是进行新城疫病毒的MDT、ICPI和IVPI的测定。一般认为强毒株的MDT＜60h，ICPI＞1.5；中等毒力毒株的 MDT为60h～90h，ICPI为0.6～1.5；弱毒株的 MDT＞90h，IVPI＜0.6。IVPI作为参考，强毒株的IVPI常大于2.0［12］。将我们分离的毒株测得的ICPI、MDT结果与之进行比较，证明该分离毒株JN1、JN2属NDV强毒型。

在高强度的免疫压力下新城疫得到了较好的控制，但近些年来，新城疫出现了一些新的情况，在免疫过的鸡群中即使能产生高的抗体滴度，新城疫仍时有暴发，已成为威胁家禽养殖业发展最严重的疾病之一［13］。按照传统经验诊断难度大，容易延误最佳治疗时机，实验室检测是确诊该病的关键。随着疫病的流行，养殖户大量使用抗生素，导致鸡群耐药性增强，传统疫苗对流行NDV毒株的预防效果不断减弱，因此，研发新型高效疫苗，制定合理的防控措施，是迫在眉睫的大事。

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