草鱼呼肠孤病毒分子生物学研究进展

2013-08-14李永刚曾伟伟王英英石存斌吴淑勤

动物医学进展 2013年4期

李永刚，曾伟伟，王庆，殷亮，王英英，石存斌，吴淑勤＊

（1.中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业部渔药创制重点实验室，广东广州510380；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海201306）

由草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）引起的草鱼出血病给我国草鱼养殖业造成了巨大的经济损失，据不完全统计，每年由于草鱼出血病导致的经济损失至少达10亿人民币［1-2］，这严重影响了草鱼养殖者的积极性和我国淡水养殖业的健康发展，该病病原及其防控技术的研究多次被列为国家科技攻关项目。GCRV隶属水生呼肠孤病毒属，为呼肠孤病毒科新成员，是中国大陆分离的第一株鱼类病毒，也是已知的水生呼肠孤病毒属中致病力最强的病毒［3］，可使鱼种阶段的草鱼死亡率达到90%以上，还能感染青鱼、麦穗鱼、布氏鳌条鱼和稀有鮈鲫等，并能使这几种鱼出现出血病症状而死亡［4-5］。目前，已报道的 GCRV 有20多个分离株［6-10］，不同分离株在致细胞病变、毒力、基因组电泳带型、基因组序列和特征等各方面有较大差异。GCRV是双链RNA （double-stranded RNA，dsRNA）病毒，结构简单，变异迅速，因此，由GCRV引起的草鱼出血病很难防治。对GCRV的深入研究有助于更清楚的认识草鱼病毒性出血病，对该病的防控具有重要的指导意义。近几年对GCRV的病原学特性、基因组特征、蛋白及其功能、致病机理、细胞培养特性、分子生物学检测技术等方面的研究，已经积累了大量资料，为GCRV的进一步深入研究和草鱼出血病防控产品及技术的研制奠定了基础。本文就草鱼呼肠孤病毒分子生物学研究进展做简要综述，以期为草鱼呼肠孤病毒进一步深入研究和草鱼出血病的防控提供参考。

1 草鱼呼肠孤病毒一般生物学特性

GCRV是具有双层衣壳、无囊膜、立体对称的20面体球形颗粒，主要由蛋白质和核酸组成，还含有少量以糖蛋白的形式存在的糖类，不含脂类［11］。GCRV对温度有一定的稳定性，柯丽华等将GCRV接毒悬液经不同温度、不同时间处理，测其半数组织培养感染剂量（median tissue culture infective dose，TCID50），通过TCID50的变化得出，GCRV对温度有一定的稳定性，56℃条件下放置30min，其活性变化不大；反复冻融和保存温度对病毒的毒力影响较大［12］。用乙醚、氯仿等处理GCRV接毒悬液后，测得效价没有明显差异，后经证实该病毒不含脂类，故对脂溶性溶剂不敏感。GCRV对酸碱具有一定的稳定性，对酸（pH 3）、碱（pH10）处理不敏感。完整的病毒在氯化铯中的浮力密度约为1.36g／mL，在蔗糖中浮力密度为1.305g／mL，沉降系数为550S，用胰蛋白酶或精氨酸酶处理GCRV，病毒滴度略有上升。病毒核心能合成RNA聚合酶，该酶在28℃活性最强，能维持14h以上。GCRV其他毒株均有类似的结构，不同毒株病毒颗粒大小在相关报道中有较大的差异，直径范围在55nm～82nm。GCRV的核心结构在二级结构水平上与其他呼肠孤病毒成员呈现高度相似性，说明病毒双链RNA的相互作用及转录是高度保守的；而参与宿主识别和吸附作用的外壳结构蛋白则表现为极低的相似性［1］。GCRV中的RNA移位装置处于开放状态，并且缺少哺乳动物呼肠孤病毒中位于移位装置顶端相应的信号蛋白［11］。

2 草鱼呼肠孤病毒基因组特征

GCRV基因组由11个dsRNA节段组成，不同的毒株之间，病毒基因组的总分子质量差异不大，而各节段分子质量有差异。GCRV基因组的11个片段根据凝胶电泳迁移率可分为3组，即大片段（L1，L2，L3）、中等片断（M4，M5，M6）、较小片段（S7，S8，S9，S10，S11），从全基因组测序结果也证实这一点，大片段在3 600bp～4 200bp之间，中片段在2 000bp～2 400bp之间，小片段在700bp～1 700 bp之间。每个dsRNA片段都有一个或一个以上开放性阅读框（open reading frame，ORF），各片段和编码蛋白是一一对应关系。

全基因组序列信息和特征是病毒基因分型、揭示强弱毒株基因差异、探讨病毒遗传变异规律以及可能的感染和传播机制的基础。至今有报道和GenBank中能搜索到的完成全基因组测序的GCRV只有6株，分别是GCRV-873、GCRV-991、AGCR-V［3］、GCRV-HZ08［13］、GCRV-104和 GCRVGD108［10］，其他一些毒株只完成了某些节段的基因序列分析，各片段碱基数见表1。根据这些毒株的部分序列进行核苷酸序列和推导的氨基酸序列比对以及构建系统进化树分析，表明所有毒株总体上可以分为3大类，即草鱼呼肠孤病毒至少应该存在3个基因型。不同类型的毒株其各节段核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性在1.6%～56%不等［6］，而同一类型的毒株其各节段核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性都大于90%［14］。

GCRV基因组各节段基因RNA的3′端不含poly（A）尾巴，每个片段在5′和3′末端都含有特异的4bp～6bp的重复保守序列，不同的节段和不同毒株，其5′和3′末端稍有差异（表2），如GCRV-873保守序列为5′-GUUAUUU……UUCAUC-3′，其中S11的5′保守序列为5′-GUUAUUG；GCRV-HZ08和GCRV-GD108保守序列为：5′-GUAAUUU……UUCAUC-3′，其中GCRV-HZ08的S8片段3′末端保守序列为：UGCAUC-3′，GCRV-GD108的S4片段 5′-GUAUUUU，S4 的 5′保守序列为 5′-GUAUUUU ，S5的5′保守序列为5′-GUAACUU，S7的5′保守序列为5′-GUAAUUC。GCRV-104株的各节段的保守序列差异较大，除S3、S9和S11的5′保守序列为5′-GAAUUAA，其余片段5′保守序列为5′-GAAUUUA，3′各片段的保守性差异较大，其中S1、S6、S8、S9、S11为 GUCAUC-3′，S2、S4、S5、S7 为 CUCAUC-3′，S3 为 AUCAUC-3′，S10 为UUCAUC-3′。AGCRV 保守序列为 5′-GUUUUAA……UUCAUC-3′，其中S4、S5、S9和S11的5′为5′-GUUUUAU，S4的3′保守序列为 AUCAUC-3′。

表1 不同分离毒株各片段的碱基数Table 1 The number of bases in each segment of different viral strains

3 草鱼呼肠孤病毒蛋白及其功能

GCRV各基因组片段与编码蛋白的基本上是一一对应关系，现在已经确认的GCRV基因组有11个片段，但是编码12种多肽，其中7种为结构多肽，命名为VP1-VP7，5种为非结构多肽，命名为NS1-NS5，也有直接命名为V1-V12。构成病毒蛋白质双层衣壳的蛋白组分是 VPl、VP3、VP5、VP6、VP7，VP2和VP4是微量结构蛋白。其中5种非结构蛋白分别是NS80、NS38、NS31、NS26、NS16。也有按病毒多肽加多肽分子质量大小命名的，如王炜等根据GCRV-875病毒多肽的分子质量大小，将其分为3个组，第1组为VP130（VP表示病毒多肽，数据为分子质量，单位为ku，即130ku，下同）、VP120、VP113和VP107，第2组为VP75、VP65、VP60和VP52，第3组为VP42、VP39和VP31。基因组及其所编码的多肽链的研究结果表明，GCRV-873基因组节段L1、L2、L3、M4、M5和S10分别编码病毒核心衣壳的6种多肽，即 VP130、VPI15、VP100、VP90、VP80和VP36，节段M6和S7分别编码病毒外层衣壳的结构多肽VP73和VP67，节段S8和S9分别编码分子质量为52ku和41ku的多肽链；节段S11编码分子质量分别为29ku和19.5ku的两种多肽链。

表2 GenBank收录全基因序列毒株的两端保守序列Table 2 The end conserved sequence of the complete genome in different viral strains included in GenBank

GCRV基因组编码的多肽多与病毒粒子的结构多肽分子质量基本是一致的，但是有个别分子质量大小不一致，如GCRV-873基因片段S8、S9和S11编码的多肽链与病毒衣壳中的结构多肽链在分子质量上就有所差异（S8、S9编码多肽为52ku、41 ku，而结构多肽为VP50、VP43；S11编码2条多肽，而结构多肽为VP27），其他多肽链大小都是一致的。节段S8、S9和S11编码的这些多肽链被推测，可能为结构多肽的非成熟中间产物，需要在宿主细胞内通过后加工造成分子质量的增大或减小，抑或为非结构多肽，有待于进一步深入研究。

不同毒株间的同源性比较有助于对毒株更清晰的认识，对了解毒株基因的来源也具有重要意义。现有资料报道HZ08与AGCRV各片段编码的蛋白质氨基酸序列同源性在14%～45%之间，HZ08与GCRV-873各片段编码的蛋白质氨基酸序列同源性在11%～46%之间［6］，其他毒株间同源性比较未见报道。

现在对GCRV编码蛋白生物学功能的研究还不够系统，但是其他呼肠孤病毒的研究成果对推断GCRV编码蛋白的生物学功能有一定的指导意义，根据呼肠孤病毒家族中同源蛋白功能相似的原则，对GCRV编码蛋白的功能已经初步明确，但是还需要更加系统的研究才能对其功能有更加深刻的认识。根据已有的研究，已得知VP1是形成跨越内外两层蛋白层的开放通道，具有甲基转移酶的活性，可以帽化转录的RNA，在鸟苷酸转移反应中，其组氨酸发生质子化，可增强VP1活性［15］；VP2和VP4含量少，结合在病毒基因组上，不是蛋白质双层衣壳的组分，分别具有RNA多聚酶和NTP酶的活性［11］；VP3是构成内层蛋白层的基本骨架，具有NTPase及解旋酶活性，可以绑定dsRNA；VP5和VP7形成异源二聚体，600个二聚体构成完整病毒的外衣壳蛋白，VP5拥有Asn-42-Pro-43蛋白水解位点，可能在病毒感染中起到诸如细胞渗透的作用，VP7含有1个锌指序列，可以调节基因表达，与病毒感染细胞的吸附有关；一个GCRV病毒粒子含有120个VP6，内外两层衣壳通过VP6相互作用，对内层VP3骨架蛋白分子起稳定结构的作用，对钉状突起蛋白起弱相互作用；NS80含有coiled coil弯曲片段，可以形成多聚体，在病毒早期形态发生阶段起作用；NS38是形成包涵体的引发因子，和NS80共同作用形成病毒加工工厂——包涵体；NS31是病毒在细胞中形成后释放阶段起作用，与病毒粒子的释放、扩散和细胞融合密切相关［16］；NS26是水生呼肠孤病毒特有的蛋白质，没有同源蛋白，含ATP-依赖性的RNA解螺旋酶功能性位点。

4 草鱼呼肠孤病毒细胞培养特性研究

病毒研究离不开细胞，细胞培养分离病毒对研究病毒的生物学特性、致病历程、致病机理和病毒保存等具有重要意义。王迎喜等［17］、邱涛等［18］的研究表明，GCRV能感染细胞并能在细胞中大量增殖，同时产生合胞体状细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）。现在针对GCRV已经建立了很多草鱼细胞系，如草鱼肾细胞系（CIK、GCK-8），草鱼肝细胞系（L8824），草鱼性腺细胞系（CO、GCO），草鱼脑细胞系（CIB），草鱼吻端细胞系（PSF、ZC-7901），草鱼鳍条细胞系（CF、CFS），草鱼鳔细胞系（GSB），草鱼胚胎细胞系（CP-80、GCB）等。

已报道的 GCRV 有20多株［7，9，19］。研究显示，毒株不同，感染相同细胞的特征不同，不同毒株接种同一细胞，有的毒株可感染细胞产生CPE，而有的毒株感染细胞并不产生CPE，但都能在培养细胞中复制。不同毒株在不同细胞中病变也不同，如：GCRV-873能够引起CIK、CAB、FHM 和GCO产生典型的细胞病变；GCRV-V（越南分离毒株）、GCRV-HZ08和GCRV-9014在CIK、CAB、FHM、GCO、EPC和CCO中不出现细胞病变，GCRV-V盲传3代后能检测到病毒粒子；GCRV-991能在CIK和FHM细胞系上能很好的增殖，而在EPC上不能生长；这些毒株在哺乳动物BHK、Vero细胞系上不能生长［20］。不同株GCRV感染细胞的能力与其感染鱼体的毒力存在差异，有的毒株（如GCRV-873）对培养细胞的感染力较强，但是对鱼体的毒力却较弱，有的毒株恰恰相反（如 GCRV-861）。另外，GCRV对培养细胞的特异性往往较对鱼体的特异性差，例如，GCRV不能感染团头鲂但能感染其组织细胞系BCC。不同类型的GCRV毒株感染不同的敏感细胞，均能从其维持液中直接提取到该病毒的核酸。一定浓度的精氨酸处理病毒吸附过程，以及采用细胞和病毒共培养的方法，可提高GCRV在CIK细胞上的培养滴度［11］。

不同基因类型的毒株接种细胞后病变表型不同。以GCRV-873和GCRV-HZ08为例，GCRV-873接种细胞后，需要一个适应的培养过程，在第1代至第3代的感染培养物中，病变不明显，往往没有CPE，但随着病毒传代感染力逐渐增强，病变才逐渐明显；而HZ08接种细胞一直都没有CPE产生。病毒在细胞中增殖都有周期性，从体外培养的GCRV-873增殖情况总体上来看，在体外细胞培养中的最适增殖温度为28℃，一般感染12h后即开始增殖，24h～72h大量增殖，培养细胞出现典型的CPE，5 d左右达到最大增殖，此时病毒的滴度最高，以后逐渐趋于平缓。HZ08接种细胞后，不出现明显CPE，无法对接毒后的细胞做定性描述。刘宝芹等［21-22］用FQ-PCR对GCRV-HZ08株病毒在不同细胞系中的增殖情况定量分析，结果表明，GCRV-HZ08株接种细胞增殖后，终浓度与初始接种浓度呈正相关。在28℃条件下，分别以GCRV-HZ08和GCRVJX09-01感染CIK细胞96h后病毒的拷贝数对数为纵坐标，以细胞培养液pH为横坐标作相关曲线，两条曲线的变化规律一致，即两株病毒的增殖情况和培养液pH之间的变化关系是一致的pH 5～9条件下，96h后病毒拷贝数处于较高水平；而在强酸强碱条件下病毒的拷贝数相应较低；10种不同细胞对GCRV-HZ08株增殖量最大的细胞是GSB，增殖量达8.966 0×106拷贝／μL，显著高于病毒含量仅次于GSB的CIK（4.614 9×106拷贝／μL）。刘宝芹等［12］还对GCRV-JX09-01在10种细胞中的增殖情况进行了定量分析，结果表明，该毒株在各种细胞中产生的病变效应与GCRV-873毒株类似，只是与873株相比，其增殖量最大的细胞系是GSB，而不是CIK。GCRV-JX09-01和GCRV-HZ08两种不同毒株在不同细胞中的培养特性和增殖情况见表3［22］。

5 草鱼呼肠孤病毒致病机理

GCRV的侵染分为潜伏期、前驱期、明显期和转归期（痊愈期或死亡）四个阶段。潜伏期鱼无明显表观现象，活动与摄食正常，持续时间长短与水温及病毒浓度密切相关。前驱期时间较短，仅1d～2d，病鱼最早出现尾鳍末端发黑，体表暗黑色，停止摄食，离群缓游等症状；明显期病鱼出现明显出血症状，离群独游，对水流反应迟钝或沉于水底，有时身体失去平衡在水面打转，一般1d左右死亡。

我国鱼病防治工作者长期以来对GCRV感染草鱼后的各项指标进行了研究。在GCRV感染草鱼鱼种的潜伏期和前驱期，鱼体红血球、血浆总蛋白、血和尿素氮明显减少，病鱼乳酸脱氢酶同功酶（lactate dehydrogenase isoenzyme，LDHI）紊乱。在某些感染鱼中，甚至会出现LDHI多出一条区带的现象。在出血病流行期间，血液指标存在血清钾含量增加，钙含量减少，病鱼白细胞和淋巴细胞百分率降低，单核细胞和中性粒细胞百分率增高等现象；各脏器小血管内皮广泛受损，引起弥散性血管内凝血并形成微血栓，耗去大量凝血因子，引起出血，使循环血量大为减少，微血栓形成和血液淤带，阻闭了局部的微循环，使正常代谢发生障碍，从而导致脏器组织病变。

表3 不同基因型毒株在不同细胞系中的培养特性Table 3 The culture characteristics of different viral strains in different cell lines

郭帅等［23］对草鱼呼肠孤病毒的致病机理进行了详细的研究报道，GCRV进入细胞和其他病毒一样，总体分为四步：首先，病毒的进入，病毒核酸和蛋白质的合成，病毒粒子的组装和病毒的释放。第一步，在病毒进入细胞阶段主要靠VP5和VP7等外衣壳蛋白发挥作用，VP7决定病毒与细胞的吸附，VP5酶解产生N-端小片段具有在膜上穿孔的功能，协助病毒进入细胞。第二步，在病毒核酸和蛋白质合成阶段VP1和VP2发挥作用，GCRV自身携带的RNA聚合酶VP2合成mRNA，其合成过程中5个VP1形成一个圆柱形五聚体，跨越内外2层核衣壳，方便mRNA合成过程中的转移。第三步，在病毒粒子组装过程中VP3、VP4、VP6、NS38和NS80发挥作用，NS80结合VP3和NS38共同作用形成病毒加工厂——包涵体，内层衣壳由120个VP3构成，它可结合病毒基因组和RNA多聚酶，具有NTPase酶和解螺旋酶活性，能绑定dsRNA；通常GCRV在形成包涵体后的前30min只组装内层衣壳，后30min组装外层衣壳；在病毒扩增过程中VP4和VP6起辅助作用。第四步，NS31在病毒释放过程中起重要作用，NS31编码一个跨膜蛋白，引起膜通透性增加和膜融合，新合成的病毒粒子得以从细胞膜渗透到细胞外。

6 草鱼呼肠孤病毒分子生物学检测技术

关于GCRV的检测，电镜观察是最直观有效的方法，所以在最初的研究中应用较多，但是存在着技术和仪器要求复杂、样品制备较麻烦等问题。随着现代免疫学和分子生物学技术在鱼类病毒病检测和疾病诊断中的应用，使GCRV的检测变得日益简便和快速。王铁辉等应用反转录-聚合酶链式反应（reverse transcription PCR，RT-PCR）技术成功地扩增了GCRV-861基因组的特异节段，建立了快速检测GCRV的新方法。应用该技术对纯化的GCRV核酸进行RT-PCR扩增，最小检测量可达0.1pg病毒核酸。对人工感染GCRV-861毒株的草鱼病料进行RT-PCR扩增，不仅能检测到发病期显症病鱼存在GCRV，还能检测发病前期及愈后病毒携带者中存在GCRV；该法还能检测自然发病鱼及染毒细胞中的GCRV。RT-PCR技术是目前检测GCRV最为灵敏而特异的方法，对草鱼出血病的早期诊断和预防，及抗病育种都具有重要意义。之后，针对不同毒株，不同检测目的，先后改进和建立了多种用于GCRV检测的RT-PCR技术，王晓丰等［24］、王菁等［25］、张兰兰等［4］都相继建立了 RTPCR检测GCRV的方法。

由于GCRV有许多不同毒株，它们之间的基因型也有很大差异，为方便快捷的检测并鉴定不同类型的毒株，多重RT-PCR应运而生。迟妍妍等［26］建立了双重PCR检测GCRV和GCRV-GD108的方法。曾伟伟等［14］把已发现的GCRV株型分为Ⅰ 、Ⅱ和Ⅲ3个类型，针对这3个类型的GCRV建立了三重PCR检测方法，该方法具有较高的敏感性，在较短时间内可一次性完成GCRV鉴定工作，该方法适用于GCRV的快速诊断和草鱼出血病分子流行病学调查。

由于常规的电镜技术、常规RT-PCR和多重RT-PCR只能进行定性检测，而不能定量，但是在研究GCRV过程中不仅需要定性描述，而且需要定量分析，因此荧光定量PCR技术也相继发展起来。周勇等［27］建立了灵敏度高，特异性强的检测GCRV的 TaqMan real-time PCR 法。刘宝芹等［12，21］针对GCRV-HZ08和GVRV-JX0901分别建立了快速、灵敏、特异的FQ-PCR检测方法。安伟等［28］也建立了荧光定量PCR方法。荧光定量PCR的建立对对草鱼出血病在实验室快速诊断和病毒定量分析具有重要意义。

不管是电镜技术还是PCR技术，都需要复杂的操作过程和精密的仪器设备，适合在实验室检测，并且费时费力。草鱼出血病危害巨大，造成很大经济损失，因此及早发现、及早防控有助于减少经济损失。鉴于此，李玉平等［29］和王晓丰等［30］等建立了RT-LAMP技术用于检测GCRV，该方法设备要求简单，操作简便、快捷，特异性强，敏感性高，非常适合野外检测工作，但是该方法假阳性率比较高，结果不可靠，实际应用还有待改进。

上述GCRV分子生物学检测方法各有优点和缺点，需要根据不同的场合、条件等选择使用其中的一种或者多种方法。此外，需要对已有的检测方法进行改进或者研制新的检测方法，使其更简便化、快速化和准确化。

7 展望

过去数年在草鱼呼肠孤病毒的基本病原学特性、毒株的分离与鉴定、细胞系的建立和细胞培养特性研究、基因组序列分析、蛋白功能研究、分子生物学检测方法等各方面研究取得了一些进展，但是关于该病毒的传播途径与致病机理、强弱毒株之间在基因水平的差异、基因分型和血清学分型、流行情况、有效的疫苗和合适免疫途径等各方面的研究进展较为缓慢。

由于GCRV的抗原性都较差，而且不同的试验方法得出的结论差异较大，使得该类病毒至今尚未建立标准血清型；也由于基因组序列信息的缺乏，GCRV至今也没有进行系统的基因分型。因此，对不同GCRV毒株进行全基因组序列分析，基于丰富的全基因组序列特征等信息，提出GCRV基因分型方法和进行基因分型是今后研究的方向之一。GCRV是分节段的RNA病毒，具有高度的变异性，各种强毒株、弱毒株和变异株在我国并存；不同地区的GCRV流行株存在较大差异，不能产生交叉免疫保护；目前使用的细胞灭活疫苗和弱毒疫苗的毒株均是几十年前分离到的毒株，可能和现在的流行株已有较大的差异。要想有效的预防和控制草鱼出血病，必须深入了解GCRV的遗传变异规律和传播机制，开展草鱼出血病的分子流行病学调查，弄清不同地区GCRV的流行病学特点。并基于流行病学调查结果，研制适合的新型疫苗。草鱼出血病为一种危害严重的暴发性疾病，变异快和流行广是导致其暴发的直接原因，明确GCRV的传播途径和感染机制，切断其传播途径和减少其感染机会是从源头上控制草鱼出血病暴发的有效手段，这也将是今后GCRV研究的重点方向之一。

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