两面针水提物对酵母朊病毒作用研究

钟正伟

（承德石油高等专科学校化学工程系，河北承德067000）

迄今为止对朊病毒引起的哺乳动物中枢神经系统疾病如疯牛病、羊痒病、人库鲁病和克－雅氏症等仍缺乏有效的治疗办法和治疗药物，利用构建的动物模型、动物细胞模型、无细胞模型和酵母模型进行抗朊病毒药物的筛选目前是国际生物学和医学领域的研究热点［1－5］。借助酵母朊病毒［PSI＋］易于检测的遗传表型（红色为正常型，白色为致病型）及其与哺乳动物具有严格种间屏障的优势，Bach等建立了一种安全、高效的基于酵母朊病毒［PSI＋］的抗朊病毒药物筛选模型，该模型首先利用酵母朊病毒［PSI＋］的表型初筛抗朊病毒候选药物，然后采用SDS－PAGE／Western blot技术通过分析药物作用后酵母朊病毒聚集状态来检测候选药物的抗朊病毒效果；利用该模型Bach等从近4 000种小分子化合物中筛选发现了菲啶（phenanthridine）、6－氨基菲啶（6－aminophenanthridine）、胍那苄（guanabenz）等11种化合物可以使酵母朊病毒［PSI＋］的白色表型治愈为红色表型，同时其淀粉样蛋白聚集状态可以转换为可溶单体状态［6－8］。

尽管目前研究发现了戊聚糖多硫酸酯、四磺酸基酞菁、两性霉素B、奎纳克林、菲啶和朊病毒抗体ICSM18等一系列代表性抗朊病毒候选药物，但遗憾的是这些候选药物在动物试验中的效果并不理想［2－5］。近年来文献报道了某些中药对与朊病毒疾病具有相似致病机制的阿尔茨海默病具有一定疗效［9－10］，这暗示了从中药领域寻找抗朊病毒药物的可能性。本文借助酵母朊病毒［PSI＋］表型并结合蛋白水平检测朊病毒聚集体大小的半变性琼脂糖凝胶电泳技术（semi－denaturing detergent－agarose gel electrophoresis，SDD－AGE），研究发现了两面针水提物具有明显的治愈酵母朊病毒［PSI＋］效果，这一方面为传统中药两面针作为抗朊病毒候选药物提供了试验依据，另一方面也将推动抗朊病毒中药制剂的筛选研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae：MATα kar1 SUQ5 ade2－1 his3Δ202 leu2Δ1 trp1Δ63 ura3－52 erg6：：KanMX，［PSI＋］，美国国立卫生院（NIH）的Masison D博士惠赠；将［PSI＋］细胞划线于含有5mmol／L盐酸胍的1／2YPD固体平板上培养7d后，分离红色单菌落得到［PSI＋］细胞。

1.1.2 培养基 1／2YPD培养基：酵母浸粉5g／L，蛋白胨20g／L，葡萄糖20g／L，固体平板加入20 g／L琼脂。

1.1.3 试剂和药品 两面针根购自安徽亳州市真源堂药业有限公司；酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、琼脂粉均购自上海奥博星生物科技有限公司；盐酸胍（guanidine hydrochloride，GuHCl）购自美国Sigma公司；兔抗Sup35抗体与HRP标记的羊抗兔IgG购于上海西宝生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 两面针水提物的制备 制备两面针水提物按参照文献［11］方法并做适当调整，将两面针根粉碎后80℃烘干，称取粉末适量置于烧杯中，加相当于中药量20倍的纯水浸泡2h后，煮沸30min，抽滤。药渣加5倍水，煮沸20min，抽滤。合并滤液并于5 000r／min离心5min，去除沉淀后减压浓缩成相当于原药1g／mL的药液，灭菌后4℃保存备用。

1.2.2 两面针水提物对酵母生长的抑制作用分析采用二倍稀释法结合血球计数法分析两面针水提物对酵母生长的影响［12］。取试管数支，以1／2YPD液体培养基对两面针水提物进行对倍稀释，浓度分别为500mg／mL～62.5mg／mL，然后在每管中按10%接种量接种活化培养的OD 600nm为0.5的酵母菌悬液，生长对照为不加药的1／2YPD液体培养体系。上述各接种物体系置24℃下培养24h，其间每间隔4h采用血球计数法监测培养体系中酵母总菌落的变化。

1.2.3 两面针水提物对酵母朊病毒［PSI＋］表型治疗作用分析 按参照文献方法并做适当调整［6］，［PSI＋］酵母细胞在30℃过夜活化培养后，调整菌液OD 600nm为0.2左右，按10%接种量分别接种到含有指定浓度两面针水提物的1／2YPD液体培养体系，所有体系于24℃震荡培养5d，在培养时间内间隔24h更换培养基和药物。每天取培养液稀释后涂布于1／2YPD固体平板，平板于24℃培养7d，观察菌落颜色变化，照相并统计不同表型菌落的比例。

1.2.4 SDD－AGE／Western blot技术分析两面针水提物对酵母朊病毒［PSI＋］的治疗效果 SDDAGE／Western blot试验流程按参考文献［13］进行，将两面针水提物作用酵母细胞5d后涂布培养的1／2YPD固体平板上出现的不同颜色菌落活化后接种到1／2YPD液体培养基中30℃培养约12h，到菌液OD 600nm＝1.5左右时停止培养，离心收集细胞，然后加入裂解缓冲液，用珠磨仪裂解细胞，离心收集上清得到蛋白样品；进行15g／L的琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后用在0℃、100V条件下转膜1h，将蛋白转移到PVDF膜上，兔抗Sup35抗体（1∶2 000）孵育1h，4℃过夜，HRP标记的羊抗兔IgG（1∶5 000）孵育1h，采用ECL发光试剂盒对其进行放射自显影检测，获得图像信息。

2 结果

2.1 两面针水提物对酵母生长的影响

研究表明，抗朊病毒化合物盐酸胍治疗酵母朊病毒［PSI＋］依赖于细胞分裂［14］，而且分析候选药物对酵母朊病毒［PSI＋］的治疗作用采用24℃液体培养，并间隔24h更换培养液的试验方法要求酵母细胞具有较快生长速度［6］，为此首先分析了24℃培养条件下不同浓度两面针水提物对酵母细胞生长的影响。如图1所示，不加药情况下，酵母生长繁殖正常，菌落数量有规律地增加；两面针水提物浓度为62.5mg／mL、125mg／mL时，对酵母生长的影响不大，菌落数量增长规律与未加药的基本接近；两面针水提物浓度为250mg／mL、500mg／mL时，酵母细胞总数基本维持在接种时的水平，仅在小范围内波动，这表明两面针水提物浓度高于250mg／mL时抑制酵母生长。

图1 两面针水提物对酵母生长的影响Fig.1 Effects of aqueous extract fromZanthoxylum nitidum on cell growth of yeast prion

2.2 两面针水提物对酵母朊病毒［PSI＋］表型的影响

酵母朊病毒［PSI＋］是酵母翻译终止因子Sup35p的淀粉样聚集形式，在［PSI＋］细胞中，Sup35p主要以聚集体形式存在导致无义突变抑制，产生终止密码子通读现象，使ade2－1突变的［PSI＋］细胞在腺嘌呤缺乏的培养基上生长为白色菌落；在被治愈的［PSI－］细胞中，其Sup35p主要以可溶形式存在，非无义抑制的ade2－1突变株需要在含有腺嘌呤的培养基上生长，细胞由于累积腺嘌呤合成途径中的红色中间产物而形成红色菌落，这个表型系统可用来初步分析药物对［PSI＋］表型的治疗效果［6，15］。依据结果2.1，研究25、50、75、100、125mg／mL两面针水提物对酵母朊病毒［PSI＋］表型的治疗作用，如图2所示，阳性对照5mmol／L盐酸胍作用白色［PSI＋］细胞后产生的红色菌落随着作用时间增加而增多；作用5d后红色菌落比例为94.8%；两面针水提物浓度为25mg／mL时作用［PSI＋］细胞不产生红色菌落，与不加药阴性对照的结果相同；当两面针水提物浓度高于25mg／mL时，作用［PSI＋］细胞后产生的红色菌落比列与药物作用时间、药物剂量均呈现较好的正相关性，并且125 mg／mL的两面针水提物作用［PSI＋］细胞5d后红色菌落比例为90.2%，仅略低于阳性对照的作用效果，这表明两面针水提物对酵母朊病毒［PSI＋］表型具有明显的治疗作用。

图2 酵母朊病毒［PSI＋］在两面针水提物作用不同时间后的表型变化Fig.2 Phenotype changes of［PSI＋］cells after treatment with ZA in different time

2.3 蛋白水平分析两面针水提物对酵母朊病毒［PSI＋］的治疗作用

Bach S等［6］在蛋白水平分析候选药物对酵母朊病毒［PSI＋］的治疗效果时采用的传统SDSPAGE／Western blot技术仅能分析朊病毒能否发生聚集，而近年来发展的半变性琼脂糖凝胶电泳（SDD－AGE）结合 Western blot技术能够精确检测朊病 毒 聚 集 体 大 小［13，16－17］，因 此 引 入 SDD－AGE／Western blot技术分析两面针水提物作用酵母朊病毒［PSI＋］细胞后的朊病毒聚集体大小。如图3所示，对照的［PSI＋］细胞朊病毒Sup35p主要以大分子聚集体形式存在，而［PSI－］细胞朊病毒Sup35p主要以可溶的小分子单体形式存在，两面针水提物作用 ［PSI＋］细胞5d后白色菌落的朊病毒Sup35p聚集体大小与［PSI＋］细胞相似，说明这些菌落没有被治愈；两面针水提物作用［PSI＋］细胞5d后红色菌落的朊病毒Sup35p主要以单体形式存在，与［PSI－］细胞的朊病毒Sup35p大小相当，说明这些菌落为两面针水提物治愈的［PSI－］细胞。

图3 SDD－AGE／Western blot分析两面针水提物对酵母朊病毒［PSI＋］的作用Fig.3 Analysis of effects of ZA on yeast prion［PSI＋］cells with SDD－AGE／Western blot

3 讨论

本文借助酵母朊病毒［PSI＋］表型和蛋白水平的SDD－AGE／Western blot技术分析了两面针水提物的抗朊病毒作用；研究结果表明两面针水提物对酵母朊病毒［PSI＋］具有明显的治疗效果。前期研究表明菲啶和某些菲啶衍生物能够治愈酵母朊病毒［6］，另外两面针提取物中的苯并菲啶类生物碱成分如氧化两面针碱、二氢白屈菜红碱、去－N－甲基白屈菜红碱等与菲啶具有相同的母体结构［6，18］，推测两面针水提物能够治愈酵母朊病毒［PSI＋］可能与其生物碱成分有关，但这仍需要更多的研究来证实。重要的是，本文研究报道了传统中药两面针水提物具有治疗酵母朊病毒活性，一方面为两面针作为抗朊病毒候选药物提供了试验依据，另一方面也将促进从中药领域寻找朊病毒疾病治疗药物的研究。

［1］ Ghaemmaghami S，May B C，Renslo A R，et al.Discovery of 2－aminothiazoles as potent antiprion compounds［J］.J Virol，2010，84（7）：3408－3412.

［2］ Sim V L，Caughey B.Recent advances in prion chemotherapeutics［J］.Infect Disord Drug Targets，2009，9（1）：81－91.

［3］ Trevitt C R，Collinge J.A systematic review of prion therapeutics in experimental models［J］.Brain，2006，129 （9）：2241－2265.

［4］ 宋有涛，吴宪远，何星蓉.抗朊病毒药物筛选模型的研究进展［J］.辽宁大学学报：自然科学版，2009，37（4）：289－293.

［5］ 钟正伟，宋有涛.朊病毒治疗候选药物的研究进展［J］.中国人兽共患病学报，2011，27（9）：828－835.

［6］ Bach S，Talarek N，Andrieu T，et al.Isolation of drugs active against mammalian prions using ayeast－based screening assay［J］.Nat Biotechnol，2003，21（9）：1075－1081.

［7］ Bach S，Tribouillard D，Talarek N，et al.A yeast－based assay to isolate drugs active against mammalian prions［J］.Methods，2006，39（1）：72－77.

［8］ Tribouillard－Tanvier D，Béringue V，Desban N，et al.Antihypertensive drug guanabenz is activein vivoagainst both yeast and mammalian prions［J］.PLoS One，2008，3（4）：e1981.

［9］ 何金生，张 莹，洪 涛.靶向PrP及Aβ的治疗性抗体研究进展［J］.中国科学，2010，40（8）：679－684.

［10］ 赵敬堃，王德生.中药与中药有效成分治疗阿尔茨海默病的研究进展［J］.中国中西医结合杂志，2008，28（1）：177－182.

［11］ 李文哲，芦 洁，孙晓宇，等.几种中药提取物和药物对乙醇脱氢酶活性影响的研究［J］.中药材，2006，29（8）：816－818.

［12］ 梁建芬，李 勇.抗菌素natamycin对酵母菌生长的影响［J］.中国农业大学学报，2004，9（1）：96－99.

［13］ 钟正伟，王莉洁，谢 辉，等.定量研究菲啶对酵母朊病毒［PSI＋］的治愈作用［J］.生物工程学报，2012，28（6）：737－746.

［14］ Byrne L J，Cox B S，Cole D J，et al.Cell division is essential for elimination of the yeast ［PSI＋］prion by guanidine hydrochloride［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（28）：11688－11693.

［15］ Song Y T，Wu Y X，Jung G M，et al.Role for Hsp70chaperone in Saccharomyces cerevisiae prion seed replication［J］.Eukaryot Cell，2005，4（2）：289－297.

［16］ Halfmann R，Lindquist S L.Screening for amyloid aggregation by semi－denaturing detergent－agarose gel electrophoresis［J］.J Vis Exp，2008，17（1）：1－4.

［17］ Song Y，Lan W J，Wu X Y，et al.Quantitative effects of magnesium chloride stress on aggregation of Sup35p in［PSI－］yeast cells［J］.Protein Pept Lett，2010，17（12）：1489－1494.

［18］ 李定祥，闵知大.两面针中生物碱的分离［J］.中国天然药物，2004，2（5）：285－288.