单增李斯特氏菌磷脂酶C(lm-plcB)基因的克隆表达及其在油脂脱胶中的应用*

余榛榛，常明，刘睿杰，金青哲，刘元法，王兴国

(食品科学与技术国家重点实验室 食品安全与营养协同创新中心 江南大学食品学院，江苏 无锡，214122)

单核细胞增多性李斯特菌(L. monocytogenes，简称Lm)是一种重要的食源性致病菌，兼性厌氧。温度适应性很强，-20℃时仍可部分存活，巴氏消毒也不能完全灭活。菌株对营养要求不高，能在物体表面形成生物膜对抗菌物质有抵抗作用，抗逆性较强，包括耐酸，耐反复冻溶，耐干燥以及耐盐［1］。Lm 在自然界中广泛存在，易在野生动物、家畜、鸟类、昆虫、污水、土壤和植物中生长，相关产品如牛、羊、家禽、乳制品、水果、蔬菜、熟肉制品、海产品中也常能检测到该菌。

研究表明，磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)是Lm 的主要毒力因子［1］，在细胞代谢、信息传递和抗血小板功能等方面起着重要作用。国内外已将其作为重要生理活性成分及医药原料，广泛应用于药品、化妆品、食品加工等领域［2-4］。PLC 的作用位点为甘油磷脂C3 位酯键，水解生成甘油二酯(DAG)及磷脂酸化合物，如磷酸胆碱、磷酸乙醇胺、磷酸丝氨酸以及磷酸肌醇等(图1)。由于PLC 水解磷脂生成的DAG 是油脂的正常组分，DAG 的变化不仅不会影响精炼油脂的品质，而且可以提高精炼油得率，近年来日益得到油脂行业的关注，将其应用于油脂酶法脱胶。

图1 磷脂酶C 水解磷脂图Fig.1 Phospholipase C hydrolyze phospholipids

PLC 酶法脱胶具有适用性广，反应条件温和，生产中节省酸碱化学品的消耗，几乎不产生皂脚和废水，经济效益增长明显等一般酶法脱胶的共同优点，但相较于其他的酶法脱胶，如磷脂酶A (Phospholipase A ，PLA)酶法脱胶，PLC 酶法脱胶不仅能大大缩短脱胶反应时间，还能有效提高毛油得率，降低毛油损耗，通常每500 mg/L 磷就可以提高约1%的油产量［5］，该特点在粮食价格持续上涨的现今社会显得尤为重要。本文通过克隆单增李斯特氏菌plcB 基因，重组表达PLC，并应用该酶对不同的植物毛油进行脱胶研究，具有较大的经济价值和现实意义。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

单核细胞增多性李斯特菌(L. monocytogenes)CICC No.21540，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC);大肠杆菌(Escherichia coli)JM109、BL21(DE3)、表达载体pET-28a(+)均由本实验室保存;克隆载体pMD18-T simple，购自大连宝生物(TaKaRa)公司。

1.1.2 主要试剂

T4 DNA 连接酶、限制性核酸内切酶NotⅠ、EcoRⅠ，均购自NEB 公司;对硝基磷酸胆碱(p-nitrophehylphosphoryl-choline，简称p-NPPC)、考马斯亮蓝R-250，购自Sigma 公司;蛋白分子质量标准(低)、Ex Taq DNA 聚合酶、DNA Marker DL10000，均购自大连宝生物(TaKaRa)公司;饱和酚、硫酸卡那霉素(Kana)、氨苄青霉素(Amp)、SanPrep 柱式质粒DNA 小量抽提试剂盒、SanPrep 柱式DNA 胶回收试剂盒，San-Prep 柱式PCR 产物纯化试剂盒、丙烯酰胺，N，N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis)，购自上海生工生物工程公司;大豆毛油，由中粮提供;菜籽毛油，由湖州新市油厂提供;米糠毛油，由镇江丹阳油厂提供;其他试剂为国产分析纯。

1.1.3 培养基

脑心琼脂培养基:心提取物5 g/L，脑提取物12.5 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖2 g/L，NaCl 5 g/L，Na2HPO42.5 g/L，琼脂15 g/L，pH 7.4。

LB 液体培养基:蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母粉5 g/L，pH 7.4。抗性筛选时加入氨苄青霉素或卡那霉素至终浓度为100 g/mL;LB 固体培养基，添加20 g/L 的琼脂粉。

TB 液体培养基:蛋白胨12 g/L，酵母粉24 g/L，甘油4 mL/L，磷酸盐缓冲液(K2HPO412.54 g、KH2PO42.31g)100 mL/L。

1.2 L. monocytogenes 基因组DNA 的提取及lmplcB 基因的克隆

L. monocytogenes 基因组的提取参照/氯仿-CTAB法［6］。

根据NCBI 上提供的L. monocytogenes 的plc 基因序列(YP 005964174.1)为模板，去掉信号肽后设计上下游引物:上游引物P1:5’-CGGAATTCATGTGTTGTGATGAATACTTACAAA-3＇(EcoRI);下游引物P2: 5 ’-ATGCGGCCGCTTATTCATTTGTTTTTTT-3＇(NotI)。PCR 反应条件为:94℃，5 min;94℃，30 s，50℃，30 s，72℃，1 min，30 个循环;72℃，10 min，4 ℃保温。

PCR 产物经SanPrep 柱式PCR 产物纯化试剂盒纯化回收后，与pMD18-T simple 连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞E. coil(JM109)，经Amp-LB 培养基过夜培养筛选阳性克隆，PCR 鉴定后测序，命名为pMD18-T-lm-plcB。

1.3 重组表达载体的构建

用限制性内切酶EcoR I 和Not I 对重组载体pMD18T-lm-plcB 和表达载体pET28a(+)进行双酶切。酶切产物经SanPrep 柱式DNA 胶回收试剂盒纯化后利用T4 DNA 连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞E. coli(JM109)，经Kana-LB 培养基筛选，并对阳性菌落进行PCR 和酶切鉴定。

1.4 重组磷脂酶C 的诱导表达

分别将表达质粒pET28a-lm-plcB 和pET28a(+)转化原核表达菌株E. coli BL21(DE3)，将获得的阳性克隆E. coil BL21(DE3)/pET28a-lm-plcB 接种于Kana-LB 液体培养基中，37℃，200 r/min 培养12 h作为种子液。随后将种子液按5%接种量接种于Kana-TB 培养基中，37℃、200 r/min 振荡培养进行发酵。当培养物OD600达到0.6 ～0.8 时，加入终浓度为1 g/L 的乳糖于37℃诱导16 h。离心收集菌体，超声破壁后利用卵黄平板法和SDS-PAGE 鉴定分析重组蛋白［7-8］。

1.5 p-NPPC 法测定磷脂酶C 酶活力

对硝基磷酸胆碱(p-nitrophehylphosphoryl-choline，简称p-NPPC)是卵磷脂的一种结构类似物。PLC 可以分解p-NPPC 生成一种显黄色的对硝基苯酚，对硝基苯酚在410 nm 处有最大吸收，可反映PLC水解p-NPPC 产生对硝基苯酚的量，从而根据对硝基苯酚标准曲线定量计算出相应磷脂酶C 活力［9-10］。

酶活单位定义为pH 7.2，37℃条件下，每分钟水解p-NPPC 生成1 nmol 对硝基苯酚所需的酶量为1个活力单位(U)［11］。酶反应体系:50mmol/L Tris-HCl(pH 7.2)，10 mmol/L p-NPPC。100μL 的反应系统中加入10μL 的酶样品溶液，37℃反应30 min［10］。

1.6 E. coil BL21(DE3)/pET28a-lm-plcB 诱导条件的优化

诱导接种量、诱导剂添加时间、诱导温度、诱导剂浓度、诱导时间等因素对产酶的影响随重组蛋白的种类不同而有所不同。本实验通过改变单因子的方法对诱导条件进行优化，以p-NPPC 法获得的酶活大小作为优化参考标准。

1.6.1 诱导接种量的优化

在培养基中分别接入1%、2%、3%、4%、5%的菌种，不同接种量分别做3 个平行。扩培4 h 后添加终浓度为1 g /L 的乳糖开始诱导表达，37℃、200 r/min 诱导24h 后检测发酵液OD600值，并取等体积的发酵液超声破碎后测定酶活力，确定最适接种量。

1.6.2 诱导剂添加时间的优化

分别在重组菌接种后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 h 添加终浓度为1 g /L 的乳糖进行诱导，37℃、200 r/min 诱导24 h 后确定最适诱导时间。实验方法同上，每个时间梯度设置3 个平行实验。

1. 6. 3 诱导温度的优化

添加乳糖至终浓度1 g /L 后分别在18、25、30、37℃对重组菌株进行诱导表达，每个温度梯度设置3个平行实验。实验方法同上，根据实验结果确定最适诱导温度。

1. 6. 4 诱导剂浓度的优化

在上述已优化的诱导基础上，添加乳糖至终浓度为1、2.5、5、8、10、15、20 g /L 进行梯度诱导，不同的乳糖浓度设置3 个平行实验。实验方法同上，根据结果确定最适诱导剂浓度。

1. 6. 5 诱导时间的优化

在上述已优化的诱导条件下进行诱导，分别诱导4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h 后，检测发酵液OD600值，并取等体积的发酵液，超声破碎细胞后测定酶活力大小，确定最适诱导时间。不同的诱导时间设置3 个平行实验。

1.7 磷脂酶C 脱胶效果

将植物毛油(大豆毛油、菜籽毛油、米糠毛油)于具塞三角烧瓶中水浴加热到80 ℃，加入总毛油质量0.5%，浓度45%(w/w)的柠檬酸溶液，在500 r/min搅拌20 min，进行酸预处理。将经过酸预处理的油样冷却至47℃，加入4% NaOH 溶液调节pH 至5 。再加入油重1%的蒸馏水和油重1%的重组磷脂酶C，均匀混合后，在62℃下300 r/min 搅拌1 h，进行酶反应。反应结束后将油样置于90℃水中加热10 min 灭酶，再测定磷含量［12］。

油相pH 的测定:用50 mL 离心管取油水混合物40 g，在5 000 r/min 离心10 min，弃去上层油相，向沉淀中加入5 mL 的蒸馏水，充分搅拌混合后再次在5 000 r/min 离心10 min，取离心管中水相用pH 计测定pH 值，经校正后采用。油相pH 为5.0 左右时的经验校正公式:pH 实际=pH 测定-0.3［13］。

磷含量的测定:将脱胶后的油样于10 000 r/min下离心10 min，取5 g 上层油样进行磷含量测定。油脂中磷含量测定参照GB/T5537 -2008。

2 结果与分析

2.1 L. monocytogenes 基因组DNA 的提取及lmplcB 基因的制备

以L. monocytogenes 全基因序列为模板，以引物P1 和P2 进行PCR 扩增，产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，扩增出的DNA 片段在约810bp 处，与预期大小相符(图2)。测序结果显示目的片段与L. monocytogenes 的plc 基因序列(YP 005964174.1)相似度达到99%，蛋白质序列相似度为100%。

图2 lm-plcB 的PCR 鉴定Fig.2 PCR result of lm-plcB

2.2 重组表达载体pET28a-lm-plcB 的鉴定

对构建的表达质粒pET28a-lm-plcB 进行菌落PCR 验证，在810bp 处有目的条带;进一步对pET28a-lm-plcB 进行EcoRⅠ和NotⅠ双酶切鉴定，分别获得约5 300 bp 和约810 bp 的条带(图3)，与预期结果相符。

图3 pET28a-lm-plcB 的酶切鉴定Fig.3 Restriction enzyme digestion analysis pET28a-lm-plcB by EcoRⅠand NotⅠ

2.3 E. coil BL21(DE3)/pET28a-lm-plcB 诱导表达及产物活性鉴定

E. coil BL21(DE3)/pET28a-lm-plcB 经诱导表达后超声破碎，12 000 r/min 分离上清液。利用卵黄硼砂平板分析重组PLC 的活性，结果显示:E. coil BL21(DE3)/pET28a 在卵黄硼砂平板上没有出现水解圈，重组PLC 产生乳白色水解圈，且添加10 mol/L Mg2+后水解圈明显增大，说明该重组蛋白对天然磷脂底物具有PLC 活性，Mg2+对其分解天然底物的活性具有促进作用(图4)。

SDS-PAGE 电泳结果表明 E. coil (BL21)/pET28a-lm-plcB 表达了相对分子质量约为30.4 kDa的重组蛋白，与预期大小相符(图5)。

图4 重组蛋白的活性检测Fig.4 Analysis of recombinant PLC activity

图5 重组PLC 的SDS-PAGEFig.5 SDS-PAGE analysis of recombinant PLC in E.coil BL21(DE3)/pET28a-lm-plcB

2.4 E. coil BL21(DE3)/pET28a-lm-plcB 诱导条件的优化

2.4.1 诱导接种量的优化

由图6 可知，在接种量为4%时，重组菌产酶量达到最大，约159.1 U/mL，故最适接种量为4%。

2.4.2 诱导剂添加时间的优化

图6 不同接种量对产酶的影响Fig.6 Effect of inoculation on cell density and PLC activity

由图7 可知，在接种后2h 添加乳糖，重组菌产酶量达到最大值，约411.9 U/mL 左右。故乳糖添加时间为转接后2 h。

图7 乳糖添加时间对酶活力的影响Fig.7 Effect of lactose addion time on cell density and PLC activity

2.4.3 诱导温度的优化

如图8，诱导温度为25℃时，重组蛋白的酶活力达到最大，可达到431.5 U /mL 左右。故选取发酵产酶的诱导温度为25℃。

图8 添加乳糖时诱导温度对产酶的影响Fig.8 Effect of lactose concentration on cell density and PLC activity

2.4.4 诱导剂浓度的优化

由图9 可见，在乳糖浓度为2.5 g /L 时，重组菌产酶量达到最大，约633.1 U /mL 左右，故乳糖诱导剂的最适诱导浓度为2.5 g/L。

图9 乳糖质量浓度对酶活力的影响Fig.9 Effect of lactose concentration on cell density and PLC activity

2.4.5 诱导时间的优化

由图10 可知，乳糖添加后26 h，重组蛋白的酶活力达到最大值，约为754.6 U /mL，故最适诱导时间为26 h。

图10 添加乳糖时诱导时间对产酶的影响Fig.10 Effect of lactose induction time on phospholipase activity

2.5 重组磷脂酶C 脱胶效果的初步研究

利用该重组PLC 对不同植物毛油进行脱胶，最终将大豆毛油中的含磷量从216.67 mg/kg 下降到3.705 mg/kg，磷含量降低了98.40%;菜籽毛油中的含磷量从183.7 mg/kg 下降到4.503 mg/kg，磷含量比脱胶前降低了97.55%;米糠毛油中的含磷量从306.8 mg/kg 下降到50.191 mg/kg，磷含量比脱胶前降低了83.63%。

3 讨论

本文对单增李斯特氏菌来源的lm-plcB 基因在大肠杆菌中进行了重组表达，并首次应用单增李斯特氏菌来源的重组PLC 对不同的植物毛油进行脱胶，最终使大豆毛油和菜籽毛油的磷含量降低到了5 mg/kg以下，避免了传统油脂精炼环节的脱酸处理，可以实现油脂的物理精炼。利用PLC 脱胶，油脂中的水化磷脂可以被水解生成DAG 和水溶性磷酸酯，DAG 作为油脂的固有组分可以伴随油相被回收，避免了中性油的损失，大大降低了毛油炼耗率，较温和的处理条件也显著提高了油脂的品质。因此，单增李斯特氏菌来源的重组磷脂酶C 在油脂工业中的应用具有较大的经济意义和社会效益。

为了进一步开发符合工业化生产的磷脂酶C 制剂，还需对该重组磷脂酶C 的酶学性质进一步深入研究，探索其底物特异性，针对不同毛油产品，开发混合型酶制剂，增强产品的适应性，提升制剂的稳定性。相信随着PLC 结构功能研究的不断深入和油脂酶法脱胶技术的不断完善，PLC 酶法脱胶将得到进一步推广，油脂精炼也将更加符合健康、环保和低耗的理念。

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