尼可地尔对哮喘大鼠气道反应性和肺组织T-bet/GATA-3表达的影响
2013-08-09王志强
王志强,李 杰,周 鑫
三峡大学医学院(湖北宜昌443002)
气管哮喘(简称哮喘)是一种免疫性疾病,主要与Thl/Th2平衡失调有关[1]。ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channel,KATP)是存在于多种细胞膜上的电压非依赖性配体门控通道[2],与哮喘的气道重塑及Th1/Th2失衡的众多细胞因子都有着极为密切的联系,开放与关闭该通道可能通过调节参与哮喘发生及发展的炎性细胞因子[3-4],进而使Th1/Th2的比例失衡。T-bet和GATA-3可调控Th1/Th2细胞比例,在哮喘疾病的各个阶段发挥着重要作用[5]。本研究用尼可地尔使KATP通道开放,观察其对大鼠哮喘的影响,并探讨与T-bet/GATA-3基因表达有关的可能机制。
1 材料及方法
1.1 实验动物和药物 SPF级SD雄性大鼠32只,体质量180~200 g,鼠龄 70~80 d,购自武汉同济医学院实验动物中心。兔抗大鼠 NF-κBp65、T-bet、GATA-3多克隆抗体,武汉博士德生物技术有限公司;鸡卵清蛋白(ovalbulium,OVA),Sigma公司;尼可地尔,5 mg/片,日本中外制药株式会社;地塞米松磷酸钠注射液,5mg/ml,湖北天药药业有限公司。
1.2 方法
1.2.1 动物分组和哮喘模型复制 随机将32只雄性大鼠分为四组,分别为正常对照组、哮喘模型组、地塞米松治疗组(DEX治疗组)和尼可地尔治疗组(NCR治疗组)。模型复制方法按文献进行[6]。雾化吸入OVA前30min,NCR治疗组按3 mg/kg雾化吸入尼可地尔,DEX治疗组按0.5 mg/kg雾化吸入地塞米松,正常对照组雾化吸入生理盐水。雾化进行4周,可成功复制气道重塑模型,于末次激发24 h后麻醉处死动物,取相关组织进行检测。
1.2.2 肺泡灌洗液(BALF)白细胞分类计数 最后一次雾化激发结束24 h后,麻醉并处死大鼠。结扎右肺,用5ml生理盐水灌洗左侧肺并回收灌洗液,共3次,回收率>80%。经离心(2000 r/m,4℃)10 min,细胞一经沉淀便立即涂片,经自然干燥后,进行Wright染色,在光镜下记数200个细胞作分类。
1.2.3 大鼠气道反应性的检测 将部分气管迅速置于Kreb's液中,剥离外周组织,按每2~3个软骨环为一个螺旋将气管剪成螺旋条。螺旋条的一端与挂钩相连,另一端与张力换能器相连。浴槽中加入Kreb's液,并通入95%的O2和5%CO2。加螺旋条张力负荷至1 g,然后平衡1 h,每隔20 min换一次Kreb's液体,待稳定后记录螺旋条收缩曲线,然后加入 0.1ml的氯化乙酰胆碱(0.01mol/L),每隔 15 min用一次药。观察并记录螺旋条张力的变化。
1.2.4 检测 NF-κBp65 及 T-bet/GATA-3 表达 取100mg冰冻肺组织和兔抗大鼠 NF-κBp65、T-bet、GATA-3多克隆抗体,按试剂盒叙述方法制备样本,用Western Blot方法检测样本各种蛋白表达。
2 结果
2.1 肺泡灌洗液白细胞分类计数 与正常对照组相比,哮喘模型组BALF中嗜酸性粒细胞(EOS)数明显增高(P<0.01);NCR治疗组和DEX治疗组BALF的EOS数比哮喘模型组显著降低(P<0.01)。见表1。
表1 各组大鼠BALF白细胞分类计数(±s,n=8)
表1 各组大鼠BALF白细胞分类计数(±s,n=8)
注:与哮喘模型组比较,*P<0.01
组别 单核细胞 嗜酸性粒细胞 淋巴细胞 中性粒细胞正常对照组 12.3±1.8 3.6±1.2*21.7±4.3 51.3±8.225.1±4.6 59.0±8.3哮喘模型组 14.2±2.2 18.6±4.7 16.5±4.2 50.8±7.6 DEX 治疗组 10.5±3.6 6.9±3.3* 30.6±5.8* 52.0±8.9 NCR 治疗组 18.4±3.7 8.6±1.8*
2.2 尼可地尔对哮喘大鼠气道反应性的影响 大鼠气管螺旋条张力变化值对照组为(0.251±0.077)g,哮喘模型组明显增加,为(0.616±0.187)g(P<0.01)。DEX治疗组和NCR治疗组的气管螺旋条的张力变化值分别为(0.196±0.077)g 和(0.342±0.117)g,反应结果显著低于哮喘模型组(P<0.01),而与对照组比较并无显著差异(P>0.05)。
2.3 Western Blot法检测肺组织 NF-κBp65 蛋白结果 与正常对照组、DEX治疗组和NCR治疗组相比,哮喘组NF-κBp65含量显著增高(P<0.01)。与正常对照组比较,DEX治疗组表达量显著低于正常组(P<0.05),其它无显著差异。见图1。
2.4 Western Blot法检测肺组织 T-bet/GATA-3 蛋白结果 与正常组相比,哮喘组大鼠肺组织中T-bet表达量降低,而GATA-3表达量升高,差异有显著性意义(P<0.01);DEX治疗组和NCR治疗组T-bet含量明显高于哮喘组,GATA-3含量则明显低于哮喘组(P<0.01)。NCR治疗组GATA-3表达量低于正常组。见图2。
图1 各组大鼠肺NF-κBp65蛋白结果
图2 各组大鼠肺T-bet/GATA-3蛋白结果
3 讨论
KATP通道开放可以导致气道平滑肌松弛[7]、抑制平滑肌细胞过度增殖,可逆转哮喘发生的各个阶段[3,8-9],被认为是有效的控制气道重塑的关键点。Th1/Th2比例失衡已被证实伴随着哮喘发生的各个阶段,而作为Th1/Th2特征性因子的 T-bet/GATA-3则成为衡量二者水平的具体因子。另有研究证实[10],NF-κB 信号通路可以改善 Th1/Th2比例失衡。开放KATP通道,极有可能通过调节PKC-NF-κB 信号通路,改善 T-bet/GATA-3平衡,进而逆转Th1/Th2比例失衡,调节众多参与哮喘发生及发展的炎性细胞及因子,最终控制哮喘气道重塑的发生及气道炎症的发展。PKC、NF-κB、Th1/Th2与哮喘气道重塑和KATP通道都有着极为紧密的联系,但这三者之间以及它们与KATP通道的关系目前未明确。本实验观察到尼可地尔(NCR)可以一定程度的缓解以嗜酸性粒细胞浸润为主的肺组织病理变化,显著降低哮喘大鼠的气道反应性。NCR作为第一个具有类硝酸酯类作用并应用于临床的KATP通道开放剂,可以增加细胞膜对钾离子的通透性,减少细胞钙离子内逸,从而松弛气道平滑肌,改善大鼠的哮喘表现。在分子学水平上,KATP通道开放剂可以有效地抑制哮喘大鼠肺组织中NF-κBp65和GATA-3蛋白的表达、上调了T-bet的蛋白表达,逆转了T-bet/GATA-3比值。这些结果提示KATP通道开放剂-尼可地尔对哮喘大鼠有一定疗效,其作用有可能是通过抑制NF-κBp65的表达,从而在一定程度上阻断了NF-κB信号通路,进而逆转了以T-bet/GATA-3比例失衡为标志的Th1/Th2比例失衡,可能减轻气道重塑的病理变化和哮喘病情。
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