丁苯酞注射液对大鼠脑出血后血肿周围组织脑含水量及自由基代谢的影响

倪小宇 巩娟娟 齐素华

脑出血(ICH)是一种严重危害人们健康的疾病。在我国ICH的发病率为(120～180)/10万,每年新生病例约130万,死亡100万,其中一半是在2 d内死亡[1],而病情的恶化往往与ICH随后继发的脑水肿有关。Wagner等[2]认为早期将血肿清除可减轻ICH血肿周围脑水肿及血脑屏障的破坏;Cherubini等[3]认为氧自由基的产生与脑水肿形成有关。国内外有关丁苯酞注射液神经保护作用的大部分研究都集中在急性脑缺血模型,有关丁苯酞注射液作用于脑出血模型的实验研究报道较少。本研究通过丁苯酞对大鼠脑出血含水量及氧自由基影响，探讨其对脑出血的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与动物模型的制备

1.1.1 主要器材与试剂 动物立体定位仪（江湾二型），超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂（南京建成生物工程研究所提供），丁苯酞（石药集团恩比普药业有限公司提供）。

1.1.2 动物与分组 取健康成年SD雄性大鼠72只，体重250～300 g，由徐州医学院动物中心提供，随机分成对照组、假手术组、脑出血组、脑出血+丁苯酞组，每组18只，其中每组6只用于脑组织含水量测定，6只用于SOD测定，6只用于MDA测定。

1.1.3 动物模型制作 参照Rynkowski等[4]报道的方法制作动物模型，大鼠经10%水合氯醛溶液(350 mg／kg)腹腔麻醉后，固定于立体定位仪上。选择注射点为右侧尾壳核(前囟前0.2 mm，中线右旁开 3.0 mm，进针深度 5.8 mm，即尾壳核位置)。脑出血组取大鼠尾血50 μL，用微量进样器立即注入右侧尾壳核，以10 μL/min的速度匀速注射，留针10 min后缓慢移出针头。对照组在相同位点注入50 μL生理盐水。假手术组在相同位点只进针而不注血，留针5 min后拔除。丁苯酞治疗组于脑出血模型成功后半小时(25 mg／kg)腹腔注射一次，一天2次，注射3 d,动物都于72 h后处死，分别进行检测,研究显示大鼠脑出血后72 h脑含水量及氧自由基变化最明显[5]。

1.2 实验方法

1.2.1 脑组织含水量测定 将大鼠在模型制作成功后72 h再次麻醉，立即断头取出脑组织，应用干一湿重法，迅速分离出血肿周围脑组织，并立即称湿重。然后将组织块放入电热烘箱中1000℃烘烤24 h，再称干重。按下列公式计算：脑组织含水量(%)=(湿重－干重)／湿重×100%。

1.2.2 SOD及MDA测定 将大鼠在模型制作成功后72 h再次麻醉，立即断头取出脑组织，分析天平称重,按1∶9(W/V)加入生理盐水,玻璃匀浆器匀浆,2000 r/min,离心12 min,取上清液。分别采用黄嘌呤氧化法和硫代巴比妥酸显色法测定,严格按试剂盒操作程序进行。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件包进行数据分析，各组数据以均数±标准差(±s)表示，两组间比较用t检验，配对资料采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑组织含水量测定 假手术组和对照组脑血肿周围组织含水量无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。脑出血组血肿周围组织含水量显著增加，明显高于假手术组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，同时丁苯酞治疗组血肿周围组织含水量较脑出血组有显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 脑出血和丁苯酞治疗后脑组织血肿周围脑含水量的变化（±s）

表1 脑出血和丁苯酞治疗后脑组织血肿周围脑含水量的变化（±s）

注：与脑出血组比较，aP<0.05

组别 例数 脑含水量（%）假手术组 6 72.37±0.93a对照组 6 72.83±1.07a脑出血组 6 81.73±0.73丁苯酞治疗组 6 74.23±0.57a

2.2 SOD及MDA测定 假手术组和对照组SOD、MDA测定无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。脑出血组MDA显著增加，SOD显著降低，和假手术组、对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，同时丁苯酞治疗组较脑出血组MDA值明显降低（P<0.05），SOD值明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表 2。

表2 脑出血和丁苯酞治疗后脑组织血肿周围MDA、SOD的变化（±s）

表2 脑出血和丁苯酞治疗后脑组织血肿周围MDA、SOD的变化（±s）

注：与脑出血组比较，aP<0.05

组别 例数 MDA（nmol/mg·prot） SOD(U/mg·prot)假手术组 6 8.87±1.89 47.26±2.12对照组 6 9.03±1.77 46.73±2.03脑出血组 6 27.21±2.12 26.83±1.91丁苯酞治疗组 6 15.43±2.04 39.16±1.88

3 讨论

急性脑出血中，脑损伤、脑水肿形成不仅由于血肿的占位效应和对周围脑组织的直接破坏[6]，血肿内炎性细胞活化、化学物质对周围脑组织继发性损害也非常重要，其中氧自由基机制是其中的重要原因[7-8]。自由基大量产生后攻击中枢神经系统内不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化，使膜通透性增加，膜功能丧失，线粒体功能障碍，溶酶体破裂，细胞溶解和组织水肿，大量微血管内皮细胞坏死，通透性增加，脑水肿形成[9-10]等一系列损害。丁苯酞对脑缺血再灌注损伤的保护作用已经得到公认，有研究显示[11]，可能与以下机制有关，保护缺血脑组织和改善脑能量代谢，抑制自由基损伤，抑制炎症损伤，抑制Ca2+超载，抑制细胞凋亡等。但是丁苯酞在脑出血中的应用很少，本实验研究表明，丁苯酞可以显著改善脑出血血肿周围的脑含水量及有效清除氧自由基从而起到保护作用，但是丁苯酞有抗血小板作用[12]，它应用到脑出血中的安全性如何，时间点、剂量的选择等一些列问题都有待于进一步研究。

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[3]Cherubini A,Polidori MC,Brebnocchi M,et al.Antioxidant profile and early out come in stroke patients[J].Stroke,2000,31(10):2295.

[4]Rynkowski MA，Kim GH，Komotar RJ，et a 1.A mouse model of intracerebral hemorrhage using autologous blood infusion[J].Nat Protoc，2008,3（1）：122-128.

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[12]徐皓亮，冯亦璞.丁基苯酞对大鼠血栓形成及血小板功能的影响[J].药学学报，2001，36（5）：329-333.