响应面优化超声辅助提取羊栖菜中无机砷

张金玲，钟耀广,*，万金庆，乔勇进

(1.上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306；2.上海市农业科学院农产品保鲜加工研究中心，上海 201403)

羊栖菜广泛分布于我国沿海地区，是一种营养丰富的食用藻类，并且具有多种药用价值[1]，但羊栖菜中高含量的砷对人体危害很大。在自然界中，砷以无机砷和有机砷两种形式存在，各种价态与形态的砷化物毒性相差很大[2-3]，其中，As2O3属剧毒物，据上海市卫生防疫站对小鼠的LD50口服实验得出，无机砷中的As2O3含量为22.9～27.7mg/kg，而有机砷中甲基胂酸锌的含量折算成As2O3进行比较，其毒性小了7倍多，毒性相对较低[4]。因而，目前国际上常以无机砷含量进行卫生学评价。羊栖菜等海藻类物质对砷的富集较强[5]，海水中砷含量为3～6mg/kg，羊栖菜能将砷浓缩3～6万倍，据朱亚尔等[6]报道，羊栖菜中无机砷含量为45.53mg/kg，GB 2762—2005《食品中污染物限量》中规定海藻中无机砷不大于1.5mg/kg[7]，羊栖菜中无机砷含量常常超标，所以，在羊栖菜的利用和加工中必须及时检测和有效地控制无机砷含量。无机砷的检测中关键问题是无机砷的有效提取，提取时既要破坏对无机砷有吸附、配合作用的有机质，使提取完全，又要避免在提取过程中，试样中有机砷转化成无机砷[8]。用盐酸浸提能破坏有干扰的有机质，同时，盐酸可与无机砷生成待测的气态砷化氢的中间产物氯化砷，所以采用盐酸浸提法是可取的[9-10]。

响应面法(response surface methodology，RSM)是利用合理的试验设计方案，采用多元二次回归方程拟合多个因素与多个响应值之间的函数关系，通过回归方程寻求最佳工艺参数[11]。目前，响应面分析法被广泛用于提取工艺优化的研究，例如吴功庆等[12]采用响应面分析法对月季花多糖提取工艺进行优化研究，Sinha等[13]采用响应面法对花瓣中天然染料的提取工艺进行优化研究。董旭等[14]研究了响应面优化法用纤维素酶提取山核桃蒲多酚类物质，建立了四因素三水平的响应面设计方法，得到纤维素酶法提取山核桃蒲多酚的二次多项数学模型。

目前，超声辅助法提取羊栖菜中无机砷的研究未见报道，本实验采用该法对羊栖菜中无机砷进行提取，并通过响应面分析法对相关工艺参数进行了优化，为羊栖菜的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

羊栖菜样品产于浙江温州。

6mol/L盐酸；2g/100mL硼氢化钾+0.5g/100mL氢氧化钠溶液，临用前现配；5g/100mL硫脲+5g/100mL抗坏血酸溶液，临用前现配。

砷标准溶液：编号GBW(E)080622，0.100g/L，上海市计量测试技术研究院。砷标准使用液：吸取砷标准溶液用0.6mol/L盐酸稀释至1.0μg/mL。实验所用玻璃仪器用2mol/L硝酸浸泡24h以上；实验用水为去离子水。

1.2 仪器与设备

AFS-9130型顺序注射双道原子荧光光度计 北京吉天仪器有限公司；专用砷编码空心阴极灯 北京有色金属研究总院；SK3310HP型科导超声波清洗器 上海科导超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原理

在一定的超声波条件下，用盐酸浸提羊栖菜中的无机砷，在浸提后的溶液中加入抗坏血酸-硫脲，把五价砷还原成三价砷，在酸性介质中，以硼氢化钾或硼氢化钠为还原剂，将三价砷转化为砷化氢，由载气(高纯氩气)带入石英原子化器，受热分解为原子态砷，在特种砷空心阴极灯的照射下产生原子荧光，荧光强度与一定浓度范围的砷溶液呈正比，与标准系列比较定量[15-17]。

1.3.2 测量条件

仪器测量参数见表1。

表1 原子荧光法测量参数Table 1 Working condition for AFS

1.3.3 样品处理

将羊栖菜(鲜样含水量约78%)样品捣碎，称取0.2g(称准至0.001g)左右于25mL具塞比色管中，用6mol/L盐酸溶液定容，混匀。置于预热过的超声波中，使样品充分浸提，取出冷却，过滤，若混浊再次过滤，获得待测溶液。

1.3.4 样品测定

取待测溶液4mL于10mL具塞比色管中，加5g/100mL硫脲+5g/100mL抗坏血酸溶液1mL，正辛醇5～8滴，用去离子水定容，摇匀放置20min后待测。根据1.3.2节调整仪器工作参数，预热20～30min后开始测量，依次进行标准系列测量和样品测量，同时做试剂空白实验。

1.3.5 标准系列绘制

吸取一定量砷标准储备液(1.0μg/mL)稀释配制2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μg/L的系列砷标准溶液，分别加入5g/100mL硫脲+5g/100mL抗坏血酸溶液1mL，正辛醇5～8滴，用0.6mol/L的盐酸定容后混匀，静置20min，测定其荧光强度，以荧光强度(y)为纵坐标，无机砷质量浓度(x，ng/mL)为横坐标，作得标准曲线为：y=44.648x－8.4213(R2=0.9995)。

1.3.6 无机砷含量计算

试样中无机砷含量参照以下公式进行计算。

式中：X为试样中无机砷含量/(mg/kg)；ρ1为试样测定液中无机砷的质量浓度/(ng/mL)；ρ2为试剂空白质量浓度/(ng/mL)；m为试样的质量/g。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 浸提液浓度对荧光强度的影响

砷元素对酸的要求不是很高，在盐酸介质中有较稳定的荧光强度。分别采用3、4、5、6、7mol/L优级纯的盐酸溶液用超声波(工作频率59kHz、功率密度0.4W/cm2、温度50℃)提取同一种羊栖菜样品20min，在相同仪器条件下测定荧光强度，结果见图1。当盐酸浓度为6mol/L时，荧光强度较高。盐酸浓度过小，则提取的无机砷不完全，荧光强度小。当盐酸浓度超过6mol/L时，仪器的稳定性和重现性变差，荧光强度变小[18]。所以，本实验选用6mol/L的盐酸为提取剂。

图 1 浸提液浓度对荧光强度的影响Fig.1 Effect of hydrochloric acid concentration on the fl uorescence intensity

图 2 提取温度对荧光强度的影响Fig.2 Effect of temperature on the fl uorescence intensity

2.1.2 提取温度对荧光强度的影响

在样品用量一定，超声波工作频率59kHz、功率密度0.4W/cm2的条件下提取20min，改变提取温度进行实验，结果如图2所示。随着提取温度的升高，羊栖菜中无机砷提取液的荧光强度也升高，但当温度高于50℃后，溶液的荧光强度没有显著增加[19]，因此实验选择提取温度为50℃。

2.1.3 提取时间对荧光强度的影响

图 3 提取时间对荧光强度的影响Fig.3 Effect of extraction time on the fl uorescence intensity

在样品用量一定，超声波工作频率59kHz、功率密度0.4W/cm2、温度50℃条件下，采用不同的提取时间进行实验，结果见图3。随着超声提取时间的延长，羊栖菜中无机砷提取液的荧光强度增加，当提取时间延长到20min后，提取液的荧光强度趋于稳定，因此实验选择提取时间为20min。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 模型的建立及显著性检验

根据单因素试验结果，确定最佳条件为浸提液盐酸浓度6mol/L、提取温度50℃、提取时间20min。在此基础上根据Box-Behnken试验设计原理，综合单因素试验所得结果，选取浸提液浓度(A)、提取温度(B)、提取时间(C)3个因素，进行响应面分析，试验设计因素编码及水平见表2，试验设计及结果见表3。

表2 试验设计因素编码及水平Table 2 Variables and their coded values for Box-Behnken design

表3 Box-Behnken试验结果Table 3 Results of Box-Behnken central composite experimental

表4 回归模型的方差分析及显著性检验Table 4 Analysis of variance and significance test of the regression model

由表4可知，整体模型的显著性由F检验来判定，F=17.69，回归模型的R2＝0.9579，表明回归模型的拟合度很好，响应值的95.79%是由所选变量引起的。显著性水平P＜0.01，表明模型极显著，此外，模型方差失拟项P＝0.1223＞0.05，不显著，说明这种试验方法可靠，回归方程对试验结果拟合情况较好。从表4可以看出，所考察的因素A、B及C所对应的P值均小于0.05，说明浸提液浓度、提取温度、提取时间对于荧光强度有显著影响，且显著性大小的排序为浸提液浓度＞提取温度＞提取时间。

利用Design-Expert统计软件对表4中试验数据进行回归拟合，由Box-Behnken程序计算得到以下回归方程：

Y=651.28＋53.55A＋38.16B＋18.84C＋4.75AB－8.13AC－12.27BC－42.87A2－59.36B2－59.63C2

2.2.2 响应面分析

根据回归方程，作响应曲面图，考察所拟合的响应曲面的形状，分析浸提液浓度、提取温度、提取时间对荧光强度的影响。响应曲面及其等高线如图4所示，从响应面的最高点和等值线可以看出，在所选的范围内存在极值，即是响应面的最高点和等值线的中心。为进一步求得各因素的最优条件，对回归方程进行数学处理，令一阶偏导数为0，求得A、B、C所对应的编码值为0.634、0.339、0.081，将该条件代入模型方程，得荧光强度为675.51，根据模型计算出的无机砷最佳提取条件为：浸提液浓度6.6mol/L、提取温度53.4℃、提取时间24.4min。

图 4 各因素交互作用对荧光强度的响应面和等高线Fig.4 Response surface and contour plots showing the effects of extraction time and temperature on fl uorescence intensity

2.3 验证实验

按照响应面分析法设计优化无机砷提取的最佳工艺条件，对响应面分析法的可靠性重复进行5次平行实验发现，荧光强度分别为657.41、643.13、670.80、652.11和676.49，荧光强度的平均值为659.99(无机砷含量为4.69mg/kg)，与理论预测值675.51(无机砷含量为4.78mg/kg)的相对误差为1.87%。

3 讨 论

3.1 本研究采用超声波辅助法提取羊栖菜中无机砷，与传统的国标水浴法提取相比，该方法有很多优点。水浴法需要在60℃提取18h，超声波辅助法在50℃提取仅需20min，提取时间短、温度较低，具有方便、快速、节能等优点。本方法检测羊栖菜中无机砷含量为4.78mg/kg，国标水浴法为4.81mg/kg，该法得到的数据与国标法相近。因此，超声辅助法提取效果好，方法可行性强。

3.2 超声辅助提取法能较好地提取出羊栖菜中的无机砷，但由于产地不同、季节不同，羊栖菜中无机砷含量也会稍有差异，有待进一步研究。经检测羊栖菜中的无机砷含量高于其他海藻(海带、紫菜等)[20]，所以食用未经加工过的羊栖菜一般需要长时间用水浸泡，以降低无机砷含量。

3.3 当浸提液酸浓度比较高时，经过仪器测量的荧光强度不稳定，平行实验波动较大。

3.4 本实验采用的超声清洗机是槽式超声波清洗机，其频率是固定的，今后有待从超声频率以及超声声强、超声发射方式(探头式和槽式)等方面进一步开展研究。

4 结 论

4.1 超声波辅助法提取羊栖菜中无机砷，与传统的国标水浴法提取相比，优点较多。该法提取时间短、温度较低，具有方便、快速、节能等优点。

4.2 本实验研究了3个单因素对超声辅助提取无机砷的荧光强度影响后，再采用Box-Behnken试验对因素和水平进行优化，得出最佳提取工艺条件为浸提液盐酸浓度6.6mol/L、超声波提取温度53.4℃、超声波提取时间24.4min，在此工艺条件下，荧光强度的理论值为675.51，经验证的实际测得值为659.99，相对误差为1.87%。

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