微生物酶高效异源表达策略的最新研究进展

杨海泉，刘 龙，李江华，堵国成,*，陈 坚

(1.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学生物工程学院，江苏 无锡 214122；3.江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡 214122)

酶作为生物催化剂可应用于多个领域，酶的产率、产量、品质和功能是酶应用于工业中的重要决定因素[1]。酶的高效表达与多个因素相关：宿主的细胞生长特性、表达水平、胞内/胞外表达模式、翻译后修饰、活性蛋白等。为了实现酶的高效表达，酶表达系统的选择至关重要。重组酶已在多个宿主中成功表达，如大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、丝状真菌、乳酸菌[2-6]。由于外源基因或表达宿主性质与功能的多样性以及在细胞培养过程中不能合理监控其生理变化，目的蛋白基因在表达宿主中很难实现高效表达，酶的工业化生产受到限制。针对上述问题，本文主要总结了用于工业酶过量表达的不同微生物宿主及实现其高效表达的最新方法策略等。

1 不同表达宿主在异源表达酶方面的差异

如表1所示，不同表达系统具有各自相关特点。E. coli表达系统优点为宿主基因组信息清晰、质粒拷贝数高、突变宿主种类多等[7]。芽孢杆菌表达系统优点为具有高效分泌能力、蛋白酶活性低、质粒结构稳定、分泌蛋白可正确折叠、分泌蛋白可溶、分泌蛋白具有生物催化活性[5]。酵母表达系统优点为蛋白翻译后修饰(如糖基化)、高热耐受性、高盐耐受性等[8]。丝状真菌表达系统优点为可高效表达大分子真核蛋白、超强分泌蛋白能力、食品安全型宿主等[2]。乳酸菌表达系统特点为细胞膜上没有毒素，是食品或药品领域安全表达宿主[3]。

同时，不同表达系统在表达蛋白时，所需培养基及表达量方面也具有各自相关特点。E. coli表达系统优点为生长速度快、可高密度发酵、易培养、高产量等。例如，碱性磷酸酶在重组E. coli中表达量最高可达5.2g/L[5]。芽孢杆菌表达系统优点为发酵培养基低廉且宽泛、高效分泌能力等。例如，内聚半乳糖醛酸酶在重组B. subtilis中表达量可达0.8g/L[9]。酵母表达系统优点为菌体生长快速、碳源廉价、高密度发酵、高热耐受性、高盐耐受性、高产量、低生产成本等。例如，鼠标胶原在重组P. pastoris中表达蛋白量最高可达14.8g/L；其他重组蛋白量最高可达30g/L[8]。丝状真菌表达系统优点为易培养、高产量、高表达量等。例如，糖化酶在A. niger中表达产量可达30g/L；同时，T. reesei的蛋白表达量可达100g/L[2]。乳酸菌表达系统虽为食品级宿主，但其表达量低。例如，β-半乳糖苷酶在L. lactis中表达量可达0.225U/mL[10]。

表1 不同酶表达宿主的特点Table 1 Characteristics of different enzyme expression host

不同表达系统在转化方法方面存在较大差异。宿主转化方法主要包括化学转化法和电击转化法。E. coli宿主转化时主要采用化学转化法，该方法简单易于操作、转化效率高；同时，也采用电击转化法进行，该方法操作相对比较简单、转化效率高[11]。芽孢杆菌宿主常采用化学转化法，转化方法相对简单，转化效率一般；对于该宿主也采用电击转化法进行转化，转化方法相对比较简单易于操作；同时，芽孢杆菌也会采用其他相关方法，如原生质体转化法、重金属离子转化法等[12]。酵母表达系统转化主要采用电击转化方法进行，也有少数采用化学转化法(如氯化锂法)进行[13]。丝状真菌表达系统采用的转化方法包括原生质体转化法、醋酸锂转化法、电击转化法、基因枪转化法、农杆菌介导转化法。其中，原生质体转化法的再生频率低、周期长；醋酸锂转化法的使用范围窄；电击转化法的步骤简单、效率高；基因枪转化法价格昂贵；农杆菌介导转化法的转化稳定、成功率高、遗传稳定，为最常用的真菌遗传转化法[14]。乳酸菌转化主要采用电转化方法进行[10]。

2 异源表达微生物酶的关键问题及相关解决方案

微生物酶在异源表达时，常出现蛋白质无法正确折叠、不可溶或折叠后缺少糖基化等修饰问题导致形成无活性蛋白甚至包涵体。包涵体具有蛋白不可溶、蛋白表达量低等缺点。对于表达后出现包涵体的现象，主要出现在重组E. coli表达蛋白情况下，其他表达系统出现包涵体的概率相对较低。包涵体的形成主要由以下条件导致的：表达量过高、蛋白来源于真核系统表达时无法糖基化、错误折叠分子、重组蛋白含过多含硫氨基酸、培养条件影响(pH值、温度)、蛋白质分子间的作用力(离子键、疏水键、共价键等)等。针对上述问题，减少包涵体的形成常需要优化表达体系及相应蛋白。常采用的方法包括：与分子伴侣或折叠酶共表达、降低重组蛋白合成速率、低温诱导、诱导剂的剂量和诱导时间、培养时添加蛋白可溶性添加剂(多醇类、蔗糖、乙醇等)、采用不同质粒及表达宿主、改变蛋白结构内氨基酸组成[15-16]。针对缺少糖基化的现象，主要出现来源于真核系统中蛋白在原核表达系统中表达时，这样的蛋白可以更换成真核表达宿主(如酵母、丝状真菌)[2,8]。

胞内表达或分泌表达对蛋白在异源表达宿主中表达具有重要意义。胞内表达的优点主要包括：高纯度、简单的质粒结构、较高蛋白表达量等。但也有其缺点如：易形成包涵体、最终蛋白表达量低、产品耗费高等。分泌表达的优点为：表达蛋白纯化简单、蛋白不易水解、促进蛋白折叠、蛋白表达量高等；其缺点为信号肽运输能力有限分泌容易异常、蛋白溶解不易纯化等。通过调控蛋白分泌的关键因素可以提供蛋白的分泌表达量。调控蛋白分泌的关键因素主要包括融合宿主相应信号肽、融合蛋白、共表达分泌蛋白、共表达分子伴侣、添加促进分泌成分、采用不同质粒及宿主、控制发酵条件等[1,2,5,7-8]。

3 微生物酶在大肠杆菌中过量表达策略

E. coli作为酶常用表达宿主之一，为实现酶的过量表达可采用不同的分子操作技术与发酵策略。重组酶的表达调节是一个包括诸多相互元素的复杂系统。表达质粒的构建需要诸多因素，这些因素对于酶的过量表达水平具有关键意义。E. coli表达质粒主要包括启动子、核糖体结合位点(RBS)、转录终止子等。采用强启动子可以促进重组蛋白在E. coli中高效合成。在采用化学诱导型质粒时，采用低温诱导可以为蛋白重折叠提供足够的时间实现活性蛋白的表达。转运终止子可以增强mRNA的稳定性，增加外源蛋白的表达水平。同时，反终止子因素的应用也有利于外源基因在大肠杆菌中的表达。蛋白表达水平的高低与基因的翻译水平有重要关联。重组蛋白在E. coli中异源表达会受到密码子偏好性的制约，稀有tRNA的竞争可以严重影响基因的表达水平[17]。非常稀有的精氨酸密码子AGA和AGG会造成错误翻译，从而导致蛋白表达水平低下。通过全基因合成可优化表达基因，实现优化密码子和去掉二级结构mRNA[18]。同时，通过对目标基因稀有密码子进行突变或共表达编码tRNA基因，可以缓解密码子偏好性。为了表达可溶性蛋白，主要采用的方法包括低温培养、表达DnaK/DnaJ (Hsp70)、不同E. coli宿主选择、改变pH值、高压减弱疏水作用、共表达分子伴侣、调节细胞质Ca2+、限制生长调节、共表达等。为了提高蛋白分泌水平，采取的方法主要有信号肽优化、突变信号肽、过量表达双精氨酸转运(Tat)ABC蛋白、EDTA和溶菌酶的协调效应、洗涤剂、周质空间分子伴侣、融合蛋白、元素(如SDS、甘氨酸、Ca2+、Na+)添加、延长甘氨酸补加率、翻译调控、葡萄糖球菌核酸酶的19-残基前导肽等。

多种融合蛋白和分子伴侣均已应用于提高酶的表达水平。GSF融合常应用于提高不同重组蛋白的表达[19]。蛋白SUMO、TrxA或硫氧还蛋白的融合可以显著提高重组蛋白在E. coli中的表达量[20-22]。通过trpE基因片段在翻译水平的融合可以显著提高低表达水平基因的表达量。同时，分子伴侣对于蛋白在胞内的折叠也具有重要意义。通过共表达2个噬菌体T4编码分子伴侣可成功生产出可溶性蛋白[23]。通过共表达镰状疟疾虫分子伴侣增强了抗疟疾药物靶标环化水解酶的表达量[24]。在发酵优化产酶方面，高密度培养可以实现酶在E. coli中的高效表达。高密度培养的方法包括分批、分批补料、连续培养等。限制高密度培养的制约因素(溶解氧、二氧化碳)降低了细胞生长速率、增加了乙酸的形成、减少了混合效率等。为了降低乙酸的积累，通过代谢工程引入乙酰乳酸合酶可提高重组蛋白的表达量。

4 微生物酶在芽孢杆菌中过量表达策略

B. subtilis是又一优良蛋白基因异源表达系统，该系统可将蛋白分泌至胞外。在系列B. subtilis表达系统中，芽孢菌素调节基因表达系统是最高效的表达系统。多种重组酶在B. subtilis表达系统中成功表达[4]。B. alcalophilus的碱性淀粉酶在B. subtilis中过量表达，表达后酶的产量是野生菌表达量的76倍[4]。分子伴侣PrsA脂蛋白的过量表达可以增强B. strearothermophilus淀粉酶在B. subtilis中的分泌[9]。启动子系统是B. subtilis表达系统的重要因素。通过Pglv启动子多核酸下游转录区域位点的定点突变可促进其启动能力。

B. megaterium是一已应用于异源蛋白表达的原核宿主。B. megaterium作为表达宿主具有很多优点，如质粒结构稳定、低蛋白酶活性、培养基广泛等[5]。多种不同异源蛋白已经成功在B. megaterium中进行表达[25]。角蛋白酶在启动子PxylA和PamyL的调控下，在B. megaterium中成功表达[26]。为了减弱调节子的抑制作用，调节子DegSU转录调控促进了异源淀粉酶在B. megaterium中的高效分泌[27]。

B. brevis也是一个重要的异源蛋白表达宿主，酶异源表达后直接分泌至培养基中高效积累。在B. brevis中异源表达的酶是可溶的、正确折叠的、具有生物催化活性。B. brevis的胞外蛋白酶表达水平低下，所以宿主分泌的异源表达后的酶是稳定的、不易被降解[5]。重组磷脂酰肌醇-磷脂酶在B. brevis宿主中成功过量表达。通过分子工程手段，可以实现蛋白在B. brevis中的高效分泌。例如，真菌蛋白二硫键异构酶的表达可以增强B. brevis分泌系统的分泌能力。

5 微生物酶在酵母中过量表达策略

酵母成为重组酶表达的最适宿主之一，具有基因操作、快速生长、翻译后修饰(如糖基化)等优点。目前，已应用于酶表达的酵母宿主包括：P. pastoris、Saccharomyces cerevisiae、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces lactis、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Arxula adeninivorans、Candida boidinii等[28-34]。为进一步提高重组酶的生产，通过分子工程技术改造酵母宿主获得多种优良宿主[35]。P. pastoris是不同来源微生物酶过量表达的最常用宿主。应用广泛的P. pastoris表达宿主包括P. pastoris GS115(营养缺陷型宿主)和P. pastoris SMD1163/1165(蛋白酶缺陷型菌株)。P. pastoris有3种表现型：Mut+、Muts、Mut－。多种重组酶在P. pastoris表达系统中成功表达，如Candida rugosa LIP同工酶在重组P. pastoris中成功表达，产量为在原野生宿主中表达量的10倍[36]。重组酶在P. pastoris中高效表达需具备如下因素：序列最优化、带有分泌信号肽、合适表达质粒、最优发酵条件等。可以通过优化P. pastoris表达系统，提高其重组酶的表达量。作为快速、便捷表达质粒质粒，pBGP1-DEST和pPICZ alpha-DEST主要应用于重组P. pastoris中分泌蛋白[37]。不同的诱导方式重组酶表达量具有较大影响。由于甲醇具有一定毒性，同时在生产过程中甲醇本身具有一定危险性，所以在发酵方面甲醇诱导不适合于食品领域产品的生产，为此可以采用3-磷酸-甘油醛脱氢酶(GAP)启动子。P. pastoris高密度发酵产酶所需培养基主要包括基础盐培养基、微量元素、氨水、甘油、甲醇等。氨水作为碱性溶液可用于控制pH值，同时在发酵后期可用于提高氮源促进菌体生长。对于重组蛋白生产过程中甘油浓度过高时，甘油会抑制AOX1启动子的功能[38]。同时，以山梨醇作为共基质具有更为显著的促进蛋白表达量的效果[18]。由于氧是P. pastoris甲醇诱导发酵过程中的必须因素，所以在甲醇利用发酵过程中需要较高氧传递速率[39]。为了提高氧传递速率需要高速搅拌和富氧空气条件，这样才可能使溶解氧持续保持在合理水平[39]。在高密度发酵过程中，酵母分泌的蛋白酶对于重组酶有一定降解作用，这将严重影响酶的产量。为解决上述问题，可以采取如下方法：降低发酵pH值、添加酪蛋白水解物、改变培养基组成等[18,39]。

S. cerevisiae被认为是最安全宿主之一，在该宿主中表达的酶制剂可应用于食品、药品等领域。据报道，已市场化的尿酸氧化酶主要由宿主S. cerevisiae表达[40]。同时，还有很多重组酶在S. cerevisiae中成功异源表达的实例，例如，C. albicans Pma1p(CaPma1p)在S. cerevisiae中成功高效表达[41]。通过分子改造方法(如融合分子伴侣、基因敲除等)可以提高重组蛋白在S. cerevisiae中高效表达量。据报道，以细胞壁蛋白不同区域作为翻译融合伴侣，Paenibacillus barcinonensis内切葡聚糖酶在S. cerevisiae中获得成功表达[42]。同时，途径调节子Hac1p的调节可激活分泌途径促进重组蛋白在S. cerevisiae中的分泌。通过S. cerevisiae突变库筛选，基因MON2的敲除增强了重组荧光素酶分泌[43]。通过改变培养基的成分也可以促进重组S. cerevisiae分泌蛋白。例如，添加含富含氨基酸的培养基可显著提高S. cerevisiae合成纤维素酶[44]。

H. polymorpha宿主可以合成生产多种酶(如乙醇酸氧化酶、植酸酶等)[45-46]。培养条件(温度、pH值、培养基组成等)对重组酶表达量高低具有重要影响。据报道，重组葡激酶(rSAK)成功在H. polymorpha中表达，通过发酵优化(温度、pH值、补料、培养及组成等)后达到最高产量(1g rSAK-2/L)[46]。Y. lipolytica也逐渐应用于大分子重组酶表达、高效分泌等。Saccharomycopisis fibuligera A11酸性蛋白酶基因(AP1)在Y. lipolytica中过量表达，表达量为46.7U/mg[32]。Rhizopus oryzae脂肪酶，在强启动子XPR2的调控下在Y. lipolytica P01g中异源表达[47]。甲基营养型酵母C. biodinii是一种分泌蛋白生产的高效宿主。乙酰亚精胺氧化酶(ASOD)基因在AOD1启动子调控下，在C. biodinii中过量表达[34]。K. lactis已经成功应用于表达重组酶制剂如脂肪酶、脱乙酰几丁质酶、酯酶、半乳糖苷酶、葡糖糖化酶[32,48-50]。少数重组酶在A. adeninivorans中成功表达，如丹宁酸酶在A. adeninivorans中已成功表达[51]。

6 微生物酶在丝状真菌中过量表达策略

丝状真菌可为表达宿主用于过量生产、分泌蛋白。丝状真菌是具有高效分泌蛋白潜力的真核表达系统，能对蛋白进行翻译后修饰等。随着生物技术的快速发展，传统发酵与其他相关产业开始逐渐重视丝状真菌表达宿主的研究与应用。用于蛋白表达的丝状真菌包括Aspergillus、Trichoderma、Penicillium、Rhizopus、Fusarium等[52]。丝状真菌表达的异源蛋白主要分为2类：工业酶制剂和高等生物的基因产物(蛋白药物等)。丝状真菌的表达水平除了少数蛋白产量偏高外，其他异源蛋白的产量远达不到高水平。为此可以在转录、翻译、翻译后修饰加工、分泌和胞外降解等不同水平进行改造，提高蛋白的表达量。到目前为止，被开发用于重组蛋白生产的丝状真菌宿主并不多。本节主要探究与分析2个主要宿主Aspergillus和Trichoderm的现状及前景。

Aspergillus是重要工业重组酶制剂生产丝状真菌之一。A. niger和T. reesei等几种重要真菌中发展起来的DNA介导转化系统开启了探索以真菌为蛋白表达系统的研究新方向[52]。A. niger和A. oryzae是食品安全型宿主，适合生产食品、药品级酶制剂[53-54]。多种重组蛋白分别在宿主A. niger或A. oryzae中成功异源表达。糖化酶基因(glaA)已在A. niger中成功过量表达[55]。据报道，序列中的酪氨酸和天冬酰胺组成可提高重组蛋白表达水平[56]。同时，catR启动子的诱导或抑制作用可用于增强A. niger中重组蛋白的生产[57]。宿主A. oryzae在酶生产方面具有高效生产与分泌能力，也是一株重要蛋白表达宿主。一种新型细菌植酸酶成功在宿主A. oryzae中表达[58]。聚酮合酶(PKS)在启动子gpdA的作用下，在宿主A. oryzae中成功表达[59]。

Trichoderma属表达宿主主要包括：T. reesei、T. altroviride、T. vireus。在表达系统T. reesei方面的研究相对较多，但在T. altroviride和T. vireus表达系统方面的研究尚处在起步阶段。据报道，纤维二糖水解酶cbh1强启动子可以提高纤维素酶在宿主T. reesei中异源表达效率[60]。不同表达质粒对酶在宿主T. reesei中异源表达具有重要影响。Lü等[61]构建了2个可应用于大分子酶基因表达的质粒(pWEF31、pWEF3)。在强启动子T. reesei cel7A (chh1)的调控下，3个来源于Chaetomium thermophilum CBS 730.95的木聚糖内切酶基因(Ct xyn11A、Ct xyn11B、Ct xyn11C)在中T. reesei成功表达[62]。Penicillium oxalicum B3-11内切木聚糖酶基因(PoxynA)在强启动子pdc的调节下，在宿主Trichoderma reesei中成功表达[63]。

7 微生物酶在乳酸菌中过量表达策略

随着生物技术、基因组、蛋白组等技术的发展，乳酸菌逐渐成为在重组蛋白高效表达方面非常具潜力宿主之一。乳酸菌细胞膜上没有毒素，其表达的产物直接与人类健康有关系。因此乳酸菌成为食品安全级微生物，可应用于食品工业和生物制药等领域重组蛋白表达[64]。关于乳酸菌异源表达蛋白的一些关键技术已经相继出现，主要包括：不同诱导系统、不同表达系统、调控系统、菌株修饰、表达质粒、启动子、增强诱导、分泌系统等[3,65]。乳酸菌表达系统具有多种食品级选择标记，主要包括：糖类选择标记(乳糖选择标记、D-木糖选择标记、蔗糖选择标记等)、细菌素抗性选择标记、营养缺陷型选择标记、抗金属离子选择标记和噬菌体选择标记等[66-67]。

在乳酸菌中，L. lactis是一株目前乳酸菌中常用于重组蛋白表达的菌株。多种重组蛋白已经在L. lactis中成功异源表达。过敏原蛋白基因与质粒pNSH重组后，在重组L. lactis NZ9000中成功表达[68]。同时，已有不同诱导系统用于在L. lactis中重组蛋白表达。例如，乳酸链球菌肽诱导型调控基因广泛应用于L. lactis的诱导系统中[69]，这个系统提供了严谨的控制表达系统和蛋白表达系统。另外，出现了一些选择性诱导系统。Bifi dobacterium longum NRRL B-41409 L-阿拉伯糖异构酶(L-AI)被克隆后，在L. lactis中通过磷酸-消耗-诱导表达系统成功表达[70]。L. brevis S蛋白基因在木糖诱导表达系统(XIES)转录调控下成功表达后并分泌至胞外[71]。研究发现，增强包含5’-非翻译前导序列mRNA的稳定性可以提高重组淀粉酶在L. lactis中的表达量[72]。分泌水平是提高重组酶在L. lactis中高效表达的另一个关键因素。Baradaran等[73]成功将2条Pediococcus pentosaceus信号肽与蛋白融合在L. lactis中表达，成功获得分泌蛋白。在L. lactis表达系统中采用启动子Pnisz和信号肽SPUsp，可以获得可溶性、分泌蛋白。例如，Liang等[74]将纳豆激酶基因转入L. lactis中成功表达后，产生的重组蛋白分泌到培养基中，酶活力可达41.7U/mL。Drouault等[75]利用乳酸乳球菌NICE表达系统成功诱导表达了猪葡萄球菌脂肪酸，口服给药用于治疗脂肪痢。

8 结 语

重组微生物酶制剂已分别可以在细菌、真菌等微生物表达系统中过量表达。分析发现，E. coli表达系统在微生物酶制剂表达系统中仍占支配地位。芽孢杆菌表达系统作为高效分泌宿主主要用于重组酶分泌表达。酵母作为真核表达宿主可快速利用简单碳源生长，蛋白表达水平高，同时其表达水平亦可通过调节培养基组成成分进一步提高。部分重组酶可在丝状真菌表达系统中高效表达与分泌。虽然乳酸菌可作为食品安全型表达宿主用于食品工业和医药领域酶制剂表达，但该宿主机理研究并不完善仍需要进一步研究。随着技术不断发展，微生物酶制剂应用领域也将越来越广。这对酶制剂表达与生产的需要亦是多层次的，主要包括酶高质量、高品质、高效催化等。然而，重组微生物酶的高效生产需要高通量表达技术的支持与协助。同时，在系统水平方面，需要蛋白组学方面的综合覆盖。因此，在将来发展过程中，只有将基因筛选和表达宿主构建与工业发酵技术及后基因组技术相结合，才可能获得重组酶高效表达系统。

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