宁夏枸杞籽分离蛋白的功能特性

吴华玉，刘敦华*

(宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021)

宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)是茄科(Solanaceae)落叶小灌木的成熟果实，是我国传统的中药材，始载于《神农本草经》。枸杞既可作为坚果食用，又是一味功效卓著的传统中药材，《本草纲目》述“枸杞久服，补精气不足，易容颜变白，明目安神”，令人长寿故又名“不老子”[1]。

目前，国内对于宁夏枸杞或枸杞营养成分的分析研究主要在枸杞多糖、维生素、甜菜碱及黄酮类；枸杞籽也主要用来提取枸杞籽油[2]。对于枸杞蛋白这一重要营养成分的研究较少，且多侧重于其稳定性的研究。已知宁夏枸杞全果粗蛋白含量10.6%左右，宁夏分析测试中心测出宁夏枸杞子中含18种氨基酸，其中8种是人体必需的氨基酸(如异亮氨酸、色氨酸等)，宁夏枸杞果实中游离氨基酸占氨基酸总量的50%以上[3]。但宁夏枸杞籽中蛋白的含量和功能特性还未见报道。

宁夏枸杞中籽占全果的15%～20%，枸杞籽含油18%左右[1]。基于宁夏枸杞的独特保健功能，其籽的抗氧化生物特性更是得到广泛认同[1]，宁夏自治区生产宁夏枸杞籽油的规模越来越大，技术也越来越成熟。生产宁夏枸杞籽油的枸杞籽主要来源于生产宁夏枸杞鲜汁的副产品，枸杞籽粕作为枸杞籽取油后副产物，利用相当有限，仅用于饲料或肥料，或者直接丢弃，这造成了枸杞籽粕资源的极大浪费。经作者测定宁夏枸杞籽粕的蛋白含量在24%～30%，具有较高利用价值。在宁夏回族自治区域枸杞和枸杞籽粕资源丰富的条件下，从大量廉价的宁夏枸杞籽粕中提取食用蛋白和功能肽，充分开发利用其中的蛋白质资源，对提升我区枸杞特色产业产品的发展，缓解我国优质蛋白和功能肽需求有着重大的意义。为了充分利用这个极其巨大的优质蛋白质资源，本实验对超临界CO2萃取宁夏枸杞籽油后的枸杞籽粕进行分离蛋白的提取和功能性质研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

来源于2009年中宁产宁夏枸杞，经超临界CO2萃取枸杞籽油后得到的枸杞籽粕。

氢氧化钠、盐酸、硼酸、浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾、氯化钠均为分析纯；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

PHSJ-3F实验室pH计 上海精密科学仪器有限公司；TDL-5-A低速离心机 上海安亭科学仪器厂；79-1磁力加热搅拌器、JJ-2型组织捣碎匀浆机 常州国华电器有限公司；HZS-HA水浴振荡器 哈尔滨市东民医疗仪器厂；SHB-III循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；JDG-0.2真空冻干试验机 兰州科近真空冻干技术有限公司；DYY-6D型电泳仪电源、DYCZ-24系列双垂直蛋白电泳仪 北京市六一仪器厂；UDK127 Distillation、DK6 Heating Digester 意大利Velp公司；L-8800全自动氨基酸分析仪 日本日立公司。

1.3 工艺流程

1.4 具体操作

1.4.1 原料预处理 枸杞籽粕粉碎过80目制得实验样品，置于干燥器中贮藏备用。

1.4.2 碱提酸沉法制备枸杞籽分离蛋白及蛋白得率计算[4-6]称取一定量的枸杞籽粕，在一定料液比条件下调节pH值，控制温度和搅拌速率，提取60min，将料液在3000r/min条件下离心5min，得到蛋白提取液。再调节提取液的pH值，使其在等电点处沉淀，3000r/min条件下离心10min得到枸杞籽分离蛋白，水洗为中性后真空冷冻干燥，4℃冰箱保存备用。按式(1)计算蛋白得率。

1.4.3 指标测定

粗蛋白含量的测定：GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白质的测定》，微量凯氏定氮法；水分的测定：GB/T 5009.3—2003《食品中水分的测定》，直接干燥法；灰分的测定：GB/T 5009.4—2003《食品中灰分的测定》，干法灰化；单宁的测定：SN/T 0800.9—1999《进出口粮食、饲料单宁含量检验方法》；残油的测定：鲁氏残余法。

1.4.4 枸杞籽蛋白氨基酸含量测定

采用GB/T 14965—1994《食品中氨基酸的测定方法》，酸水解法测定。莲子粉及莲子主要蛋白组分提取液用6mol/L盐酸，110℃水解24h后减压蒸干，采用氨基酸自动分析仪测定除色氨酸(Trp)以外的17种氨基酸。

1.4.5 必需氨基酸组成模式测定[7]

将枸杞籽分离蛋白中的色氨酸含量定为1.0，分别计算出其他必需氨基酸的对应比值，构成该种蛋白质必需氨基酸组成模式。

1.4.6 枸杞籽分离蛋白功能性质的研究[8-9]

1.4.6.1 溶解性

分别准确称取0.1000g样品，加20mL蒸馏水溶解，装入6支50mL离心管中，分别调节pH值为2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5，室温静置30min。然后在一定温度下搅拌浸提30min，在3000r/min离心10min后取上清液，用微量凯氏定氮法测定上清液中样品及未处理样品中的含氮量。按式(2)计算氮溶解指数(NSI)。

1.4.6.2 吸油性

称取0.3g的枸杞籽蛋白样品放入15mL刻度离心管中，加入2.0mL大豆色拉油，搅拌均匀，室温静置30min后，2000r/min离心10min，读出游离油的体积，吸油性以每克蛋白质吸附油的毫升数表示，按式(3)计算。

1.4.6.3 持水性

称取枸杞籽蛋白样品0.5g，加入20mL水，搅拌均匀后静置20min，使之充分吸水，1500r/min离心5min，去除分离水，测定残留物的质量，以每克蛋白样品干质量吸附水的克数表示，按式(4)计算。

1.4.6.4 乳化性及乳化稳定性

称取一定量的蛋白样品溶解到50mL蒸馏水中，调节pH值为7.0，加入50mL大豆油，于10000r/min的组织捣碎匀浆机中均质5min。取一定量液体注入离心管中，1500r/min离心10min，在室温条件下以离心后乳化层占总液体的体积百分数来计算乳化性，按式(5)计算。

将上述所得乳化物在90℃条件下水浴30min，冷却至室温，1500r/min离心5min，以残留乳化层占原乳化层的百分数来表示乳化稳定性，按式(6)计算。

1.4.6.5 起泡性及起泡稳定性

称取一定量的蛋白样品，溶解到200mL蒸馏水中，调节pH7.0，然后在10000r/min的组织捣碎机中均质5min，然后倒入500mL量筒中，在室温条件下记录匀质停止时泡沫的体积，按式(7)计算起泡性。

均质停止5、10、30min后记录泡沫体积，按式(8)计算起泡稳定性。

1.4.7 枸杞籽分离蛋白的分子质量测定[10-12]

采用不连续的SDS-PAGE垂直电泳法进行测定。采用pH8.8的1.5mol/L Tris-HCl缓冲液、10%分离胶和pH6.8的1.0mol/L Tris-HCl缓冲液、5%浓缩胶。浓缩胶电压为70mV，分离胶电压140mV。电泳结束后用考马斯亮蓝R-250染色，最后用10%甲醇和10%冰乙酸的水溶液脱色至背景清晰。

2 结果与分析

2.1 组成成分分析

表 1 枸杞籽分离蛋白的组分Table 1 Compositions of Lycium barbarum L. seed protein isolate

枸杞籽粕经过碱提酸溶、真空冻干后所制得的分离蛋白呈淡乳黄色粉末，黏性较大，易吸潮，有淡淡的苦味和蛋白的香味，其组成成分见表1，分离蛋白得率为85.67%。可以看出，枸杞籽蛋白的水分含量偏高，这可能是枸杞籽分离蛋白结构松散，易吸潮。蛋白灰分较低，抗营养因子单宁去除率高，残油含量正常。

2.2 枸杞籽分离蛋白氨基酸分析

表 2 枸杞籽分离蛋白的氨基酸分析Table 2 Amino acid compositions of Lycium barbarum L. seed protein isolate mg/100mg

表 3 枸杞籽分离蛋白的必需氨基酸组成模式Table 3 Essential amino acid patterns of Lycium barbarum L. seed protein isolate

由表2、3可知，枸杞籽分离蛋白含有人体必需的8种氨基酸，EAA占总氨基酸的38.23%。对比大豆分离蛋白、莲子水溶蛋白和菜籽粕贮藏球蛋白的氨基酸组成可以看出，枸杞籽分离蛋白的氨基酸组成和含量与菜籽粕贮藏球蛋白较为接近。枸杞籽分离蛋白的氨基酸组成较平衡，只有蛋氨酸和胱氨酸含量较低，其他氨基酸比例都很合适。谷氨酸和天冬氨酸含量很高，特别是谷氨酸含量达到9.38mg/100mg，这2种物质对人的脑神经发育和增强记忆具有良好的作用。亮氨酸和精氨酸等功能性氨基酸含量也相对较高，这说明芳香族氨基酸与含硫氨基酸同样含量丰富。亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等支链氨基酸含量丰富，这对运动员骨骼肌的能量供应，肌肉合成以及延缓中枢疲劳均有极大的帮助[13]。

与FAO/WHO必需氨基酸模式相比，蛋氨酸为其第一限制氨基酸，整体氨基酸组成均略低于FAO/WHO模式，但比例较平衡，具有一定的营养价值，可以考虑进一步加工制作成为食用蛋白，作为营养食品或加工食品的配料，充分利用区域特色，带动区域工业发展。

2.3 枸杞籽分离蛋白的功能性质

所谓功能特性，是指枸杞籽分离蛋白在配制、加工、贮藏和制取过程中的理化性质，包括溶解性、组织形成性、吸水性、保水性、膨润性、乳化性、吸油性、黏度、胶凝性、起泡性等，其功能特性的优劣取决于蛋白质本身的大小与结构、环境因素(浓度、pH值、离子强度等)以及其他成分(水、糖、气味等)的存在[14-16]。

2.3.1 枸杞籽分离蛋白的溶解性

蛋白的溶解性是蛋白重要的功能特性之一，溶解性的高低直接影响到其在食品工业中的应用。因为蛋白质的水溶性对其在食品工业中的稳定性、风味等有直接的影响，不溶性蛋白质在食品中的应用是非常有限的[17-18]。

图 1 pH值对蛋白溶解性的影响Fig.1 Effect of pH on protein solubility

由图1可知，传统碱提酸沉法提取的枸杞籽分离蛋白其溶解性基本呈“V”型。在pH2～8之间枸杞籽的蛋白都有一定的溶解性，在等电点pH4.5时其溶解性最低，在pH7.5处溶解性最大，达到85%。

2.3.2 枸杞籽分离蛋白的其他功能特性

吸油性是指蛋白质吸附油的能力，它与蛋白质的加工方法、粒度、温度及所用油脂有关。蛋白质的吸水性与食品的黏度有关，它受pH值、温度、离子强度等因素的影响。乳化性是指蛋白将油水结合在一起形成乳化液的性能，影响的乳化性因素很多，主要是制品的蛋白质含量、氮溶解指数、蛋白质中碳水化合物有关。乳化稳定性是指油水乳化液保持稳定的能力。起泡性是指蛋白质在加工中体积的增加率,可起到酥松作用[19]。泡沫是由一个连续的水相和一个分散的气相所组成。蛋白质起泡能力主要取决于其可溶部分，蛋白质高溶解性是良好的起泡能力和稳定性的先决条件[20]，但不溶解的蛋白质粒子在稳定泡沫中也能起着有益作用。

表 4 枸杞籽分离蛋白的功能特性Table 4 Functional properties of Lycium barbarum L. seed protein isolate

由表4可知，枸杞籽分离蛋白具有非常好的吸油性和乳化性。根据大豆乳化性在食品中的应用，枸杞籽蛋白可以用于促进脂肪吸收或与脂肪结合的目的，起到乳化的作用。其吸油性可以用来加入肉制品中，减少肉制品加工过程中脂肪和汁液的损失，有助于维持外形的稳定[21]；还可以广泛地应用到火腿肠、面包圈等食品中。结果还表明，枸杞籽蛋白的持水性一般，起泡性不太好，但是其溶解性较好，这可能与蛋白浓度和提取温度有关[22]。其起泡稳定性较高，与高溶解性有关[21]。可以考虑继续研究枸杞籽蛋白的起泡性，作为发泡剂用于工业生产中。

总之，枸杞籽分离蛋白具有良好的功能特性，可以对其进行修饰和改良，研发宁夏枸杞的营养特性[23]。

2.4 枸杞籽分离蛋白的SDS-PAGE电泳图谱

图 2 枸杞籽分离蛋白的SDS-PAGE图谱Fig.2 SDS-PAGE of Lycium barbarum L. seed protein isolate

图 3 不同pH值沉淀的枸杞籽分离蛋白的SDS-PAGE图谱Fig.3 SDS-PAGE of Lycium barbarum L. seed protein isolate at various pH

由图2可知，枸杞籽分离蛋白条带分布均匀，出现了6条分布均匀的亚基条带，其分子质量主要分布在17～55kD。枸杞籽分离蛋白电泳图谱主要分为2个集中区域，上方区域有分子质量分别为48、35、32kD的3个主带；下方区域出现3条主带，根据迁移率计算分子质量约为20.4、19、18.5kD。其中分子质量为48kD的蛋白组分比较单一，分子质量为35、32kD的蛋白含量比较高。由图3可知，沉淀的pH值不影响枸杞籽分离蛋白的组分，这为以后的枸杞功能肽的提取纯化打下基础。

3 结 论

宁夏枸杞籽分离蛋白的氨基酸组成较平衡，蛋氨酸为第一限制氨基酸，谷氨酸含量偏高，具有较高的利用价值；宁夏枸杞籽分离蛋白的吸油性、乳化性、乳化稳定性和气泡稳定性良好，溶解性和持水性一般，起泡性则相对较差，可开发宁夏枸杞的营养特性，对枸杞籽分离蛋白进行改良，研发保健食品或食品添加剂应用于食品工业中；宁夏枸杞籽分离蛋白主要由6种不同分子质量的蛋白亚基组成，其分子质量分别为48、35、32、20.4、19、18.5kD。

以超临界CO2萃取枸杞籽油后得到的枸杞籽粕为原料生产分离蛋白，利用其优良的功能特性生产为食品添加剂，以及在此基础上开发蛋白质新产品，有着极其广阔的市场前景。目前，还有诸多问题尚在研究之中，如提取工艺的进一步优化，获得更高纯度的蛋白；功能性活性肽的开发中，枸杞籽多肽分子的氨基酸序列的确定，生物活性如抗氧化、降血脂等功能的探讨，以及分离提纯等下游工程的研究。因此，以枸杞籽粕生产枸杞籽分离蛋白等一系列产品有着深入研究的价值。

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