富硒玉米蛋白水解物中硒肽及含硒氨基酸的结构鉴定

王真真，张久亮，王 驰，侯 焘，张 岩，何 慧*

(华中农业大学食品科学技术学院，环境食品学教育部重点实验室，湖北 武汉 430070)

众所周知，硒作为人体必需的微量元素，有多种重要的生理功能，目前我国有72%的地域缺硒或属低硒地区，缺硒会引起克山病、大骨节病、糖尿病、肿瘤、肝病、心血管疾病、心肌坏死等疾病[1]。硒的存在形态有无机硒和有机硒两种，无机硒可以通过动物、植物、微生物转化为有机硒。与无机硒相比，有机硒具有吸收利用率高、生物活性强及安全性高等优点，目前日本、美国等国家已经禁止在食品中添加亚硒酸钠等无机硒[2]。市场上出现的富硒茶、富硒酵母、富硒螺旋藻等富硒保健品和食品，就是使无机硒有效转化为有机硒的很好范例。

通过对富硒玉米的研究发现，硒在玉米中主要赋存于蛋白质中[3]，生物体能将无机硒在体内进行转化，生成硒代氨基酸及其衍生物，如硒代半胱氨酸(Selneocyestine，SeCys)、硒代蛋氨酸(Selenomethionine，SeMet)、L-硒-甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)和含硒蛋白质等[4-5]。SeCys是新近认识的第21种编码氨基酸，而SeMet则可能是通过随机替代蛋氨酸掺入到蛋白质分子中[6]。目前有关玉米硒蛋白中存在何种形式的硒代氨基酸及含硒玉米肽的结构，国内外鲜见文献报道。

由玉米蛋白酶法改性后制得的玉米肽具有醒酒[7-9]、保肝[10-11]、降血压[12]、抗癌[13]等生理活性。本实验室近年来对玉米肽(源于非富硒玉米)的醒酒[8-9]、保肝[10-11]活性及机理进行了较系统的研究，本实验在此基础上，以产自世界硒都——恩施的富硒玉米为原料，通过玉米蛋白制备高醒酒活性含硒玉米肽，进而利用高效液相色谱-质谱联用法(HPLCMS/MS)，结合在线质谱数据库比对，以及液相色谱-等离子体质谱联用技术(HPLC-ICP/MS)对富硒玉米蛋白水解物中部分含硒肽及含硒氨基酸的结构进行鉴定，并对其中5种成分进行定量分析，为今后进一步对玉米蛋白水解物进行构效关系研究及富硒玉米进行高值化利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

富硒玉米，购于湖北恩施。

Alcalase碱性蛋白酶 丹麦诺维信公司；乙腈(色谱纯) 美国Fisher公司；甲醇(色谱纯) 上海国药集团化学试剂有限公司；硒代胱氨酸(SeCys2)、硒代蛋氨酸(SeMet)、L-硒-甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)和γ-谷氨酰-L-硒-甲基硒代半胱氨酸(γ-Glu-MeSeCys) 美国Acros Organics公司；硒代乙硫氨酸(SeEt) 加拿大多伦多化学试剂公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Agilent 1100液质联用仪、ZORBAX SB-C18高效液相色谱柱、Agilent 7500a型ICP-MS仪 美国Agilent公司；高效液相色谱仪 日本Shimadzu公司；CAPCELL PAK C18MG色谱柱 日本资生堂公司。

1.3 方法

1.3.1 富硒玉米肽的制备

取适量富硒玉米蛋白粉，配制成质量浓度为2.86g/100mL的水溶液，沸水浴处理30min，调温度至60℃、调pH值至8.00，按所用富硒玉米蛋白粉质量的0.6%加入Alcalase碱性蛋白酶，边搅拌边不断加入0.1mol/L NaOH溶液，维持pH8.00直至pH值不再变化，取出烧杯冷却至室温，选用截留分子质量为5ku的再生纤维素卷式超滤膜进行超滤分离，将膜透过物冻干，通过原子荧光光谱法[14]测得富硒玉米肽中硒含量为6.05μg/g。

1.3.2 富硒玉米蛋白水解物的HPLC-MS/MS分析

色谱条件：Agilent色谱柱：ZORBAX SB-C18(4.6mm× 250mm，5μm)；流动相：A：水+0.1%三氟乙酸(TFA)，B为乙腈+ 0.1% TFA；梯度洗脱：0～30min，水-乙腈：90：10～65：35；30～60min，水-乙腈：65：35～45：55；60～70min，水-乙腈：45：55～40：60；进样量：30μL；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；检测波长：230nm。

质谱条件：ESI 离子源，正离子检测模式，喷雾电压为3500V，毛细管温度为365℃，喷雾气(N2)压力为275.79kPa (40psi)；干燥气(N2)流速为10.00L/min；m/z扫描范围为240～2100。

质谱解析： 用LCMSD-Trap Data Analysis 软件对结果进行处理。对肽进行初步解析之后，在UCSF Mass Spectrometry Facility提供的3个质谱数据库(SwissProt.2012.12.3、NCBInr.2012.12.3、UniProtKB.2012.03.21)中分别进行检索，以进一步验证和确定的肽的准确结构。

1.3.3 富硒玉米蛋白水解物的HPLC-ICP/MS分析

标准品溶液包括10ng/mL SeCys2、MeSeCys、SeMet、γ-Glu-MeSeCys、SeEt。

将50mg样品溶解在1mL超纯水中，经0.45μm滤膜过滤后进样分析。

高效液相色谱仪由两个LC-10AD高压泵和CTO-10A柱温箱组成，色谱柱为CAPCELL PAK C18MG，Agilent 7500a型ICP-MS仪与HPLC在线联用，流动相：25mmol/L醋酸-醋酸铵缓冲液，体积分数0.1%三氟乙酸，pH3.1，体积分数5%甲醇；流速：1mL/min；进样体积：20μL，测定79Se及其同位素77Se、82Se，以峰面积积分定量[15]。

2 结果与分析

2.1 富硒玉米蛋白水解物的HPLC-MS/MS分析

图 1 富硒玉米蛋白水解物的质谱总离子流图Fig.1 Total ion current (TIC) of Se-enriched corn protein hydrolysates

富硒玉米蛋白水解物的质谱分析总离子流图如图1所示，从中解析出4个含硒的玉米肽段，其标注编号见图1。

以三肽为例，肽的碎片离子命名如图2所示，通常易在酰胺键处断裂，故最易生成y系列离子(yn)和b系列离子(bn)。

图 2 肽链碎片离子及其命名Fig.2 Fragment ions of the peptide and corresponding nomenclature

下面以一级图谱中m/z为490.1的肽段1的准分子离子为例，对其进行详细解析：

图 3 保留时间2.6min、m/z为490.1肽段1的一级质谱图(小图)、二级质谱图(大图)Fig.3 Primary and secondary mass spectrum of peptide 1 (retention time = 2.6 min, m/z 490.1)

表 1 m/z为490.1的肽段1的氨基酸序列分析Table 1 Amino acid sequence analysis of peptide 1 (m/z 490.1)

通过质谱数据库检索比对，可以确定何种氨基酸在碳端，还是在氮端；当遇到分子质量相同的氨基酸(例如：亮氨酸和异亮氨酸)时，可以帮助确定是何种氨基酸。由于质谱数据库中缺乏蛋白链上有含硒氨基酸的玉米蛋白数据，因此解谱时，采用的方法是首先关注玉米蛋白中含硫氨基酸——蛋氨酸和半胱氨酸附近的序列片段，再将其中的硫进行硒代，或者是甲基硒代后，算出其分子质量，然后在一级图谱中寻找分子离子；再在其二级图谱中寻找其对应的子离子碎片。在与质谱数据库中玉米蛋白的数据进行比对时，是将硒或甲基硒替换成硫。其数据库(SwissProt.2012.12.3；NCBInr.2012.12.3；UniProtKB.2010.03.21)检索结果见表2。因Se有多种同位素，肽段1中Se的相对原子质量为79，此外，Se的同位素还有77、82等。

其他3种肽段的解析与肽段1类似，不再详述，其各种碎片离子直接标注于相应的二级质谱图中，数据库检索的部分结果列于表2中。

表 2 数据库检索得到的相匹配的肽段序列的部分结果Table 2 Sequence matching in database

图 4 保留时间7.4min、m/z为446.4肽段2的一级质谱图(小图)、二级质谱图(大图)Fig.4 Primary and secondary mass spectrum of peptide 2 (retention time = 7.4 min, m/z 446.4)

图 5 保留时间9.2min、m/z为429.3肽段3的一级质谱图(小图)、二级质谱图(大图)Fig.5 Primary and secondary mass spectrum of peptide 3 (retention time = 9.2 min, m/z 429.3)

图 6 保留时间16.0min、m/z为423.8肽段4的一级质谱图(小图)、二级质谱图(大图)Fig.6 Primary and secondary mass spectrum of peptide 4 (retention time = 16.0 min, m/z 423.8)

表 3 富硒玉米肽结构解析结果汇总Table 3 Data summary of structural analysis for selenium-enriched corn peptides

通过与质谱数据库检索比对(表3)可知，m/z为423.9 的肽段其氮端是异亮氨酸，而不是亮氨酸。

2.2 富硒玉米蛋白水解物的HPLC-ICP/MS分析

图 7 样品的HPLC-ICP/MS图Fig.7 HPLC-ICP/MS analysis of samples

上述4种三肽由于缺乏相应的标样，未对其进行定量分析；此处仅对富硒氨基酸和1种二肽进行了定量分析，如图7所示，5种标样分别是SeCys2、SeMet、MeSeCys、SeEt、γ-Glu-MeSeCys，其对应的结构如图8所示。与标样相比，富硒玉米蛋白水解物在保留时间600s左右有一个峰(即图7中的6’峰)，该峰由于缺乏对应的标品，故无法鉴定其结构。样品中各化合物的定量结果列于表4中。此外，峰5为SeEt，是SeMet的衍生物。

图 8 标准品的结构Fig.8 Structure of the standards

表 4 富硒玉米蛋白水解物中含硒氨基酸及一种二肽定量分析结果Table 4 Analytical results of seleno-amino acids and a dipeptide in Seenriched corn protein hydrolysates

3 讨论与结论

通过HPLC-MS/MS、蛋白质质谱数据库比对的方法，从富硒玉米肽中鉴定了4个含硒的三肽，其氨基酸序列分别为SeMet-MeSeCys-Glu、Met-MeSeCys-Glu、MeSeCys-Glu-Asp和Ile-MeSeCys-Glu；由于缺乏标样，未对其进行定量。此外，采用HPLC-ICP/MS法，借助于标样鉴定了4种含硒氨基酸和1个含硒的二肽，并对其进行了定量分析，其含量由多到少依次为：SeMet、SeEt、γ-Glu-MeSeCys、MeSeCys、SeCys2。其中，因硒代半胱氨酸在分析过程中易二聚，形成类似二硫键的二硒键，使部分SeCys转变成SeCys2，因此SeCys2的含量中实际上包含了SeCys2及部分SeCys。有报道用HPLC-ICP/MS法测得大米含硒氨基酸中约30%的硒以SeCys的形式[16]存在；也有人用同样方法对富硒双歧杆菌菌粉中硒的形态进行了分析，结果显示其主要含硒氨基酸为SeMet，其含硒量约占总硒含量的60%[17]。本实验结果显示玉米中主要的含硒氨基酸为SeMet，而鉴定的5个硒肽中则是以MeSeCys居多。

含硒氨基酸有很好的抗氧化、抗癌[18]等作用；日本学者Yamaguchi等[7]早在20世纪90年代率先报道了玉米肽具有醒酒活性；本研究显示玉米肽的醒酒作用主要归功于其疏水性的短肽能激活乙醇脱氢酶，此外，玉米肽的抗氧化性使其能清除乙醇代谢中产生的自由基，对醒酒有协同作用[9]。含硒化合物具有良好的抗氧化性，本室之前实验显示富硒玉米肽比普通玉米肽具有更高的醒酒活性。有学者认为Glu、Pro、Ala、Leu对酒精代谢有正面作用[19]，而本实验中鉴定的4个肽段均含有Glu，因此，推测这4个肽段对酒精代谢有一定的促进作用，是否确实如此，还有待今后进行进一步的深入研究。

鉴定了富硒玉米蛋白水解物中5种含硒肽段及4种含硒氨基酸。5个硒肽均含MeSeCys，其中只有1个肽段含SeMet；但在含硒氨基酸中则是以SeMet含量最高。

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