乌骨鸡黑色素氧化降解产物成分初探

田颖刚，赵溪雁，乔娟娟，朱 胜，张 丽

（南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330047）

乌骨鸡（Gallus gallus domesticus Brisson）作为药食两用的滋补品在我国应用历史悠久，乌骨鸡的特殊性就在于其体内富含黑色素[1]。乌骨鸡黑色素具有抗诱变、延缓衰老、抑制流感病毒、清除自由基、抑制脂质过氧化等多种生理功能[2-6]。目前乌骨鸡黑色素的化学结构尚不清楚，我们围绕其结构特征和理化性质已开展了一些有益的探究工作。电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-AES）分析发现，乌骨鸡黑色素中含有Fe、Ca、Mg和Zn等多种金属元素，表明黑色素对金属离子有富集作用[7]。乌骨鸡黑色素理化性质研究表明：乌骨鸡黑色素性质比较稳定，几乎不溶于所有溶剂，对金属离子有亲和力，具有电子自旋性。乌骨鸡黑色素光谱学研究表明在紫外和可见区无明显的吸收峰，但在200～400nm之间呈现吸光值迅速增加，红外光谱表明黑色素结构中含有脂肪族结构[8-10]，但目前尚无其他化学结构研究佐证。本项目组采用NaOH-H2O2氧化降解法乌骨鸡黑色素，以傅里叶红外光谱、GC/MS对降解产物乙醚萃取物进行分析，发现乌骨鸡黑色素降解产物中存在C16～C32系列烷烃，从而为论证乌骨鸡黑色素中存在脂肪族结构提供了有力的佐证，为乌骨鸡黑色素的化学结构研究提供了一定的实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乌骨鸡 70～80日龄，购自江西泰和县；木瓜蛋白酶（40万U/g）、浓盐酸、无水乙醇、KBr、Na2SO3、30%H2O2、乙醚、氢氧化钠 试剂均为分析纯，中国国药集团化学试剂有限公司。

TDL5M型台式大容量冷冻离心机 长沙英泰仪器有限公司；TGL-16G-A型离心机 上海安亭科学仪器厂；Precisa XB220A型分析天平 瑞士；HH-4型数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；PHS-2C型pH计 上海理达仪器厂；HITACHI H-600型透射电子显微镜 日本日立；SPI型傅立叶红外光谱仪 美国Perkin-Elmer；6890型气相色谱、5973型质谱联用仪美国Agilent。

1.2 实验方法

1.2.1 乌骨鸡黑色素的精制 取泰和乌骨鸡，宰杀、去毛、头、爪、内脏，洗净。用绞肉机绞成肉泥，取肉泥50g，加入倍量水，0.1%木瓜蛋白酶，（63±1）℃酶解8h，升温煮沸0.5h，灭酶，趁热滤布过滤，滤液高速离心（10000r/min，10min），沉淀即为乌骨鸡黑色素粗品。取黑色素粗品10g，加入2mol/L的HCl 100mL，90℃回流3h后过滤，弃滤液，连续回流5次后用蒸馏水洗涤至中性，再用乙醇、CM试剂多次洗涤，干燥后即为精制乌骨鸡黑色素。

1.2.2 乌骨鸡黑色素的形态观察 取精制乌骨鸡黑色素，过160目筛，取少量与乙醇混合，超声使样品分散成均匀混合液，用玻璃毛细管吸取混合液滴2～3滴在微栅网上，置透射电镜下进行观察并记录，工作电压75kV。

1.2.3 乌骨鸡黑色素降解 精密称取乌骨鸡黑色素6份，每份100mg，置于50mL反应釜内，加入pH12的NaOH溶液20mL，以0.2mL/min的流速加入30%的H2O23.4mL，90℃保温搅拌反应，反应时间分别为2、4、8、12、16、20h，反应结束后流水冷却，加入12mL 10%Na2SO3溶液终止反应。降解液定重至40g，取混匀的降解液10g离心，蒸干上清，干燥上清干物质，沉淀至恒重，按下式计算可溶性产物得率，同法制取不含乌骨鸡黑色素样品的降解空白对照。

取降解液25g，乙醚萃取5次，每次5mL，合并乙醚，无水硫酸钠脱水，0.22μm微孔滤膜过滤，得样品，供GC/MS分析。取乌骨鸡黑色素制成悬液，同法乙醚直接萃取，得黑色素不降解空白对照样品，供GC/MS分析。

1.2.4 傅立叶红外光谱 分别称取乌骨鸡黑色素以及黑色素的降解物乙醚萃取物各1mg在玛瑙钵中混匀，研成细粉，溴化钾压片。在400～4000cm-1范围内测其红外吸收光谱。

1.2.5 GC/MS条件

1.2.5.1 色谱条件 Agilent HP-5 毛细管色谱柱（30m×250μm，0.25μm）；自动进样，进样量1μL，不分流，进样口温度250℃；程序升温：初始温度60℃，保留3min，以5℃/min的速率升至300℃，保留15min；检测器温度250℃；载气He，流速1mL/min。

1.2.5.2 质谱条件 EI电离源；电子能量70eV；离子源温度230℃；接口温度250℃；扫描周期2.84次/s，扫描范围33～500u；数据处理系统MSD chem Station；标准质谱谱库：NIST02。

2 结果与分析

2.1 乌骨鸡黑色素电镜分析

图1 乌骨鸡黑色素透射电镜图Fig.1 The transmission electron microscope image of BSFM

由图1可知，蛋白酶/盐酸法提取分离所得的乌骨鸡黑色素呈比较规则的椭球颗粒，赤道轴长和极轴长分别为33～34nm、66～67nm，边缘清晰光滑，周围无明显的附着物，说明该法所获得的乌骨鸡黑色素比较纯净，可为后期乌骨鸡黑色素结构研究提供性质稳定、纯净的原料来源。

2.2 乌骨鸡黑色素可溶性降解产物得率

图2 不同降解时间可溶性产物得率Fig.2 Yields of water-soluble products at different degradation times

由图2可知，随着降解时间的延长，可溶性产物得率逐渐增加，到12h时达到最大为56%，之后可溶性产物得率减少并基本趋于稳定，12h之后可溶性产物得率降低是由于易挥发性物质随降解时间增长而产生，并随水蒸气逸散所致。

2.3 傅立叶红外光谱分析

[11-12]方法对乌骨鸡黑色素以及黑色素的降解物乙醚萃取物红外图谱（见图3）进行分析。乌骨鸡黑色素在2961.0、2929.3、2863.6cm-1处的吸收为3000 ～2800cm-1区 脂 肪 族C-H 的 伸 缩 振 动，在1450cm-1附近的吸收为脂肪族C-H的弯曲振动，烷烃结构吸收峰强度较弱。

乌骨鸡黑色素降解物的乙醚萃取物在2954.0、2924.3、2854.2cm-1处有很强的吸收，为2960～2850cm-1区烷基C-H的伸缩振动吸收带，1461.0、1378.4cm-1为1470～1370cm-1区烷基的变形振动吸收带，且在722.7cm-1处的吸收带为725cm-1附近的CH2基的平面内摇摆振动吸收带，上述结果表明降解物乙醚萃取部分中含有-CH2-结构。

2.4 GC/MS分析

图3 乌骨鸡黑色素（a）及降解产物乙醚萃取物（b）红外图谱Fig.3 Infared spectrum image of melanin from Black-bone Silky Fowl（a）and ethereal extract from degradation products of BSFM（b）

采用GC/MS对无黑色素降解空白乙醚萃取物、未降解乌骨鸡黑色素乙醚萃取物及乌骨鸡黑色素降解产物乙醚萃取物进行分析（见图4～图7，表1），结合参考文献[13-14]及与标准质谱数据库NIST02.L匹配，结果表明无黑色素降解空白与未降解乌骨鸡黑色素直接萃取物中均未发现烷烃类结构成分，而乌骨鸡黑色素降解产物乙醚萃取部分中存在C16～C32一系列不同碳连长度的正构烷烃及非正构烷烃，这表明降解产物中的烷烃组分是乌骨鸡黑色素经过NaOHH2O2降解产生的。降解产物中烷烃以长链烷烃居多，碳数在25以上（含25）占所有烷烃含量的75.44%。推测乌骨鸡黑色素结构中可能存有长链脂肪族结构。

图4 无黑色素降解空白的乙醚萃取物总离子流色谱图Fig.4 Total ion chromatogram of ethereal extract from degradation blank

图5 乌骨鸡黑色素未降解的乙醚萃取物总离子流色谱图Fig.5 Total ion chromatogram of ethereal extract from BSFM

图6 乌骨鸡黑色素12h降解产物（a）和16h降解产物（b）乙醚萃取物总离子流色谱图Fig.6 Total ion chromatogram of ethereal extract from 12h degradation products（a）and 16h degradation products（b）of BSFM

图7 乌骨鸡黑色素降解产物（20h）乙醚萃取物总离子流色谱图Fig.7 Total ion chromatogram of ethereal extract from degradation products（20h）of BSFM

3 结论与讨论

采用蛋白酶/盐酸法分离纯化乌骨鸡黑色素，可将附着在乌骨鸡黑色素周围的蛋白质去除干净，投射电镜下可观察到游离的规则椭球颗粒的乌骨鸡黑色素，表明蛋白酶/盐酸法所获得的乌骨鸡黑色素周围无明显附着物，减少了多余蛋白质对乌骨鸡黑色素结构分析的影响，可为后期乌骨鸡黑色素的结构研究提供较为纯净、性质稳定的原材料。

Luigi Zecca等[15]通过傅里叶红外光谱、高温裂解-气质联用发现人脑黑色素中存在长链烷基类化合物。本文采用傅里叶红外光谱及GC/MS对乌骨鸡黑色素降解产物进行分析同样发现其中存在C16～C32一系列烷烃。根据GC/MS实验结果分析可知，乌骨鸡黑色素12h降解的样品中未明显出现烷烃组分，而16h降解的样品中烷烃开始出现，20h降解的样品中则出现大量不同链长的烷烃，进而推测随着降解时间的延长，烷烃种类和含量均增加，提示乌骨鸡黑色素结构中可能存有长链脂肪族结构，其来源可能为：乌骨鸡黑色素主体结构通过不同长度的脂肪族碳链连接在一起，在降解过程中碳链与主体结构间的连接被打断产生烷烃；乌骨鸡黑色素中存在的环状碳链结构，在降解过程中被打断，产生烷烃。本文结果为论证乌骨鸡黑色素化学结构中存有长链脂肪族碳链结构提供了佐证。

表1 乌骨鸡黑色素降解物（20h）乙醚萃取物中烷烃组分分析Table 1 Analysis of alkanes in ethereal extract from degradation products（20h）of BSFM

参考文献

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