面粉添加剂偶氮甲酰胺代谢物联二脲的HPLC-MS/MS检测

袁丽红，丁洪流，陈 英，姚卫蓉，*

（1.江南大学食品学院，江苏无锡214122；2.苏州市产品质量监督检验所，江苏苏州215104）

一直以来，偶氮甲酰胺（azodicarbonamide，简称ADA）被认为具有在低用量下实现安全快速氧化的效能，能改善面团的物理操作性质，使得面团中形成高筋力面团所需的组织结构，适用于做小麦粉处理剂和焙烤食品的快速发酵剂[1-2]。但是，近期有大量研究表明经过加工之后ADA的代谢产物并不安全。ADA在改善面粉品质的同时也会在高温热解条件下产生其他有害副产物氨基脲（semiearbazide，简称SEM）[3-4]；ADA还可经小麦蛋白还原可转化为联二脲（biurea，简称HDC），HDC进一步降解又可转化为SEM[5-6]，其转化规律和分子结构见图1。研究表明，SEM具有致癌性和诱变性[7-9]，欧盟国家已经禁止使用ADA[10]。但关于HDC毒性目前未见报道。因此，目前大部分研究报道主要是通过监控ADA和SEM的量来研究其转化规律。由于HDC既是ADA的转化产物又是ADA与SEM转化的中间产物，其含量的监控对于准确了解ADA在加工过程的代谢规律起着重要作用。目前关于HDC的检测方法仅有两篇报道，谢党[11]采用亚钛还原法检测工业原料中HDC的含量；Mulder等[12]用13C，15N2-SEM和13C-氰化钾合成了内标标准物13C，15N2-HDC，建立了针对HDC的HPLC-MS/MS内标定量方法，检测限达到10μg/kg，回收率80%。该文由于提取液未经净化，杂质含量较多而产生离子抑制现象，从而选择了内标定量法，同时也研究了稀释倍数对离子抑制现象的影响，得出稀释倍数大于200倍时，离子抑制现象最弱。鉴于该方法内标物合成过程复杂、成本昂贵，以及验证得出可通过增加稀释倍数降低离子抑制，而且添加ADA的面制品中HDC含量为ppm级，含量高于质谱检测所需的ppb级，通过稀释起到一定的降低离子抑制作用，本文拟采用固相萃取（SPE）净化提取液，以期通过除去溶液中杂质达到降低离子抑制的目的，从而无需内标物进行定量。本文通过研究HDC提取、SPE柱子的选择、液相分离条件、质谱检测条件等，建立针对SPE净化再采用HPLCMS/MS方法定量检测，以期为面制品中HDC检测提供一种可操作性强的简便方法。

图1 偶氮甲酰胺（ADA）、联二脲（HDC）、氨基脲（SEM）的转化规律、分子结构图及SEM检测衍生原理Fig.1 The molecule structure and metobolism of azodicarbonamide，biurea，semiearbazide and derivative principle during SEM detection

1 材料与方法

1.1 材料与设备

HDC标准储备溶液 称取0.05g（精确到0.0001g）HDC标准物质，用纯水超声溶解，定溶于100mL容量瓶中，制成0.5mg/mL标准储备液，4℃保存；乙腈、甲醇 色谱纯，美国TEDIA试剂公司；联二脲标准品 纯度均不小于99.0%，上海安谱公司；馒头 苏州超市。

液相色谱串联质谱仪 岛津高效液相色谱仪，日本岛津公司；AB SCIEX 4000 QTRAP 质谱仪 美国AB公司；色谱柱 XBridge BEH Amide色谱柱（3.5μm，4.6mm×150mm），美国Waters公司；SPE固相萃取柱 LC-18 SPE（500mg/3mL）小柱，上海安谱公司；IKA VORTEX 3漩涡混匀器 上海吉延环境仪器有限公司；TG16-WS离心机 上海卢湘离心机仪器有限公司；超声仪。

1.2 实验方法

1.2.1 HPLC-MS/MS检测条件

1.2.1.1 色谱条件 采用XBridge BEH Amide色谱柱（3.5μm，4.6mm×150mm）；柱温：35℃；流动相：等度洗脱，V（CH3CN）∶V（H2O）=70∶30；流速：0.6mL/min；时间：8min。

1.2.1.2 质谱条件 电喷雾ESI，正离子模式；扫描方式：多反应监测MRM；离子喷雾电压（Ion Spray Voltage）：5500V；离子源温度T：600℃；雾化气Gas1：55。MRM扫描参数如表1所示。

表1 HDC的MRM扫描参数Table 1 The MRM scan parameters of HDC

1.2.2 样品前处理 准确称取样品0.5g（精确到0.0001g），加入20mL 纯水，利用超声提取20min。4500r/min离心5min，取1mL上清液定容至30mL，准确取2mL稀释液过LC-18固相萃取小柱进行净化，弃去流出液，最后用5mL甲醇进行洗脱，收集洗脱液，氮吹吹至干，准确取1mL纯水定容，过0.22μm水相膜，待用。

LC-18固相萃取小柱在使用之前先用3mL甲醇、3mL水进行活化。

1.2.3 标准曲线与最低检出限 用去离子水稀释HDC标准储备溶液，配制最终浓度分别为0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0μg/L的标准溶液，并直接进行HPLC-MS/MS测定。以HDC浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。通过不断降低标准溶液浓度，取信噪比为3时的浓度为最低检出限。

1.2.4 回收率和精密度的测定 准确称取3份空白面粉0.5g（精确至0.0001g）作为基质，分别添加HDC标准溶液，使得面粉中HDC含量分别为2.0、5.0、10.0μg/kg，按照样品前处理步骤进行处理，每个浓度水平下做3个平行实验，再按照HPLC-MS/MS检测条件进行检测，测定该方法的回收率与精密度。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件

本文研究了HDC的质谱条件，证明HDC母离子（[M+H]+：m/z119）在正电喷雾条件下有较强的灵敏度，所以本文选择正电离模式ESI。HDC在正电离模式下的MS/MS子离子扫描图以及结构图如图2所示。

图2 HDC正电离模式MS/MS子离子扫描图及其结构图Fig.2 Product ion scan ESI MS/MS of HDC and the structures of the major fragment ions

2.2 色谱柱的选择

通过对比Hypersil ODS2色谱柱、XBridge BEH Amide色谱柱以及MACHEREY-NAGEL Nucleosil氰基柱三种正反相色谱柱对HDC的保留情况（见图3），证明XBridge BEH Amide色谱柱效果最好。因为HDC极性较强，在Hypersil ODS2反相色谱柱上没有保留；而在正相色谱柱上均有保留，且在XBridge BEH Amide色谱柱的峰形与响应强度比MACHEREY-NAGEL Nucleosil氰基柱的效果好，因此，为了有较好的检测效果，本实验采用XBridge BEH Amide色谱柱。

图3 HDC在不同色谱柱上的分离效果Fig.3 The chromatograms of HDC on different columns

2.3 流动相的选择

HPLC-MS/MS中常用乙腈与加入微量甲酸或乙酸的水溶液作为流动相，因为微量的酸可以促进物质电离，因此选择了乙腈作为有机相。通过对比0.1%甲酸水溶液、0.2%甲酸水溶液和纯水作为水相时HDC的色谱峰（见图4），说明用纯水作为水相时，色谱峰相应最高，峰形高而窄，且没有分叉。其原因可能是因为所选色谱柱为氨基柱，酸溶液对其柱效有较大影响。综上所述，选择乙腈作为有机相，纯水作为水相。

图4 不同流动相对HDC色谱峰的影响Fig.4 The effects of different mobile phases on the chromatogram of HDC

2.4 流动相比例与流速的选择

根据上述选出的流动相，通过不断的调整乙腈与水的比例，对不同比例流动相条件下HDC响应值与峰形进行了比较（见图5），得出当流动相V（CH3CN）∶V（H2O）=70∶30时，其分离效果与响应值最好，本研究以此作为所需流动相比例。选用上述选好的流动相比例，比较了流速0.8mL/min与0.6mL/min对分离效果的影响，发现改变流速对二者的分离与峰形影响不大，最终选用0.6mL/min，以节约溶剂。

图5 不同比例流动相对HDC色谱峰的影响Fig.5 The effect of different ratios of mobile phase on the chromatograms of HDC

2.5 线性范围与检出限

根据上述条件，采用HPLC-MS/MS检测HDC的线性范围为0.5～20μg/kg，线性方程为Y=3594.2+19523X，相关系数为0.9992，最低检出限为0.1μg/kg。

图6 HPLC-MS/MS分析HDC的标准曲线Fig.6 The standard curve of detection HDC by HPLC-MS/MS

2.6 HDC提取溶剂与提取方式的选择

图7 不同提取溶剂与不同提取方式对HDC提取效果的影响Fig.7 The effect of different extraction solvents and extraction methods on the recovery ratio of HDC

由于HDC微溶于水、N，N-二甲基甲酰胺（DMF），不溶于多数有机试剂，但鉴于DMF粘度很大，因此，分别选用极性较强的水、甲醇、乙腈、5% DMF水溶液作为提取溶剂，以及振荡提取、超声提取与涡旋提取三种提取方式对加标馒头进行了提取效果研究。根据图7可知，采用水与5% DMF作为提取溶剂、超声作为提取方式时，提取效果最好且相当，考虑到DMF粘度大，对色谱柱有影响，所以选择水作为提取溶剂。

2.7 固相萃取小柱及洗脱液的选择

分别将HDC加标面粉提取溶液通过Poly-Sery HLB SPE、NH2SPE、HC-18 SPE与LC-18 SPE四种固相萃取小柱，研究四种小柱对HDC的保留情况，结果表明，HDC在LC-18 SPE小柱上有较好的保留。由于合适的洗脱溶剂对于HDC检测的效果以及回收率有着较大的影响，本文分别将甲醇、乙腈、正己烷、乙酸乙酯作为洗脱液，研究了不同洗脱液对HDC的洗脱效果。结果表明，使用甲醇作为洗脱液时，HDC回收率最高，可达到90%以上。因此，选用LC-18 SPE（500mg/3mL）小柱，甲醇作为洗脱溶剂。

表2 LC-18 SPE不同洗脱液HDC回收率测定结果Table 2 The recovery ratio of HDC on LC-18 SPE by different eluents

2.8 精密度与回收率

回收率与精密度测定结果见表3，回收率为89.00%～102.73%，大于Mulder等[12]方法回收率80%，相对标准偏差均小于5.0%，说明本研究建立的方法可靠。

表3 加标面粉HDC回收率和精密度测定结果（n=5）Table 3 The average recovery and relative standard deviation of samples（n=5）

2.9 实际样品测定

因为面粉中ADA经过加工之后全部进行代谢生成HDC、SEM[5-6]，因此在面制品中检测不到ADA。应用本方法对10批次市售馒头中的HDC进行检测，以追踪是否添加了ADA进行。结果表明，多数样品未检出HDC，只有2个样品检出含有HDC，证明在该馒头原料面粉原料中含有ADA。

表4 市售馒头中HDC含量的测定结果Table 4 The content of HDC in market steamed bread

3 结论

本研究结果表明，采用HPLC-MS/MS法检测面制品中HDC，其线性方程为Y=3594.19+19522.69X，相关系数为0.9992，回收率为89.00%～102.73%，操作方法简单快捷，灵敏度高。

本次实验建立的利用HPLC-MS/MS法检测面制品中HDC的检测方法可以为今后进一步研究ADA与HDC、SEM的转化机理提供基础方法，为面粉添加剂的安全性评价提供理论依据。

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