等位基因特异性PCR及MLPA检测CMT患者PMP22突变基因的结果比较

史 磊，曹秉振

(辽宁医学院济南军区总医院研究生培养基地，济南250031)

腓骨肌萎缩症即 Charcot-Marie-Tooth病(CMT)，是一组由不同致病基因引起的临床表型基本相似的周围神经单基因遗传病，其主要特征为慢性进行性加重的肢体远端无力、肌萎缩和感觉损害［1］。CMT的遗传方式主要为常染色体显性遗传(AD)，也可见常染色体隐性遗传(AR)及X连锁显性或隐性遗传(XD或XR)。最常见的类型为CMT1型，其中50% ～70%的CMT1患者及90%的散发病例为CMT1A型［2］，多由17号染色体短臂11.2区(17p11.2)包含周围髓鞘蛋白PMP22基因在内的1.5 Mb的正向串联重复突变所致。目前，有效检测短片段重复突变的实验方法主要有实时荧光定量PCR、等位基因特异性PCR-双酶切、短串联重复序列分析(STR)、多重连接探针扩增技术(MLPA)等。等位基因特异性PCR具有操作简便，对操作条件要求较低等优点，但其灵敏度与可靠性有待进一步验证，且人为因素影响较大。MLPA技术是近年发展起来的一项新的基因定量技术，可同时对多基因多外显子进行重复、缺失及定量分析，且已开发出特异的CMT1型试剂盒，操作方便，灵敏度高。我们于2012年3～8月进行本研究，初步探讨等位基因特异性PCR及MLPA两种方法对PMP22基因重复突变检测的一致性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 CMT患者6例，均来源于近2年来就诊于济南军区总医院神经内科的散发病例，所有病例诊断均符合Harding于1980年制定的诊断标准［3］。正常对照为健康成人6例，均无肢体无力、肌萎缩及遗传病家族史。所有受试者征得本人知情同意。

1.2 方法

1.2.1 标本的采集与处理 抽取患者及健康对照外周静脉血3～5 mL，用EDTA抗凝，Promega试剂盒提取全血标本基因组DNA。

1.2.2 等位基因特异PCR引物设计与合成 在PMP22基因重复片段远端和近端CMT1A-REP区域内设计两对引物，分别为 F1、R1、F2、R2，引物 F1与R1、F2与R2可扩增出患者与正常人均有的远端和近端正常存在的2片段，而F1与R2可扩增出特异性重复连接片段［4］，引物序列见表1，由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 PMP22等位基因特异PCR引物序列表

1.2.3 PCR反应及条件 反应体系:总体积25 μL，其中 dNTP Mixture(2 mmol/L)2.5 μL，10 ×PCR buffer 2.5 μL，TaqDNA 聚合酶 0.125 U，基因组DNA 1 μL，上下游引物(5 μmol/L)各 2.5 μL，三蒸水13.875 μL。反应条件为在 GeneAmp PCR system 2400热循环仪上94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s，56 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 3 min，25 次循环，最后72℃延伸5 min，4℃保存。反应完成后取5 μL PCR 产物与1 μL 溴乙锭混合，0.8%琼脂糖凝胶电泳(加核酸染色液)检测产物。

1.2.4 MLPA检测 MLPA检测试剂盒 SALSA P033购自MRC-Holland，具体操作过程如下:①DNA定量及变性:取基因组DNA 1 μL，加TE稀释至5 μL，在热循环仪上98℃变性5 min后冷却至25℃。SALSA MLPA 探针杂交:分别加入 1.5 μL P033 探针混合物及1.5 μL MLPA buffer，小心混匀后 95 ℃变性1 min，60℃下杂交16～20 h。②连接及扩增:杂交后在54℃下加入连接混合物(25 μL三蒸水、3 μL连接缓冲液 A、3 μL 连接缓冲液 B、1 μL 连接酶)孵育15 min，然后98℃加热5 min以灭活连接酶，待温度降至20℃后，加入PCR反应混合物(7.5 μL 三蒸水、2 μL SALSA PCR 引物混合物、0.5 μL SALSA聚合酶)，PCR反应条件为95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，循环35次，72℃延伸20 min。③毛细管凝胶电泳检测:取0.7 μL PCR反应产物加入0.2 μL LIZ-500标记物及9 μL甲酰胺(LIZ-500及甲酰胺均为美国ABI公司生产)，80℃变性2 min后立即置冰架上冷却，最后用毛细管凝胶电泳检测(在ABI3130基因测序仪上进行)，程序结束后导出数据，结果用Coffalyser软件分析。

2 结果

2.1 等位基因特异性PCR产物检测结果 6例患者及6例健康对照均出现F1与R1、F2与R2引物扩增出来的正常条带，均未出现F1与R2扩增的特异性短片段重复的异常条带。

2.2 MLPA检测分析 根据Coffalyser软件说明，将各目的片段的峰面积除以全部内参照峰面积之和，所得该目的片段的峰面积比值，再将此峰面积比值除以相对应的正常外对照峰面积，所得比值即为拷贝数比值，从而可计算出目的片段的拷贝数。正常人该比值波动在0.7 ～1.3，1.7 ～2.3 为重复性患者［5］。运行软件分析得出:6例患者及6例健康对照的PMP22基因全部在0.7～1.3，表明所有被检测患者及对照的PMP22基因均未出现重复突变。

3 讨论

CMT是一组临床较多见的周围神经单基因遗传病，最常见的是17号染色体短臂11.2区(17p11.2)正向串联重复突变所导致的CMT1A型，此外还有40个其他不同的致病基因被定位［6］，这些基因可导致CMT2(轴突型)、CMT3、CMT4、CMTX、CMTDI等类型，所有类型的CMT患者的临床表型基本相似。目前，该病的诊断主要依靠家族史、临床表现、神经电生理及周围神经活检，致病基因的检测应用较少，但其可以更进一步确诊并明确该病的亚型，为临床诊断提供更准确的依据。根据国内外文献的报道，PMP22基因重复突变所致CMT的患病率最高，所以本研究我们主要检测了临床搜集的CMT患者PMP22基因是否存在短片段重复突变。

等位基因特异性PCR是直接对PMP22基因交换热点区设计引物扩增出特异性连接片段，再经限制性酶切来验证产物。Kon-Ping Lin等根据已被共识的近端和远端CMT1A-REP序列设计出了PMP22等位基因特异性引物，共有4种扩增方式，扩增产物可进一步被EcoRI和NsiI两种酶验证［7］，由于我们的样本均未扩增出异常的片段条带，故无需用两种酶进行验证。该方法的应用现已比较成熟，其优点是简便易行，对操作条件及成本要求较低，但其灵敏度和准确性仍需进一步验证，因此可作为临床上基因筛查的第一步。而新技术MLPA-CMT1A试剂盒的探针基本覆盖了PMP22基因外显子的所有热点区域，且能同时检测基因的重复与缺失，敏感度及准确度较等位基因特异性PCR更高，且MLPA与荧光定量PCR、STR等方法相比也具有一定的优势:①可同时检测多基因多外显子的重复或缺失，②对DNA模板定量及纯度要求较低。当然，MLPA也有自身的缺点和限制，比如价格稍昂贵、对实验室的配置条件要求较高等。因此，两种方法对特异性短片段重复突变的检测都具有不可替代的作用和意义。在临床患者初筛或基础设施比较简单的实验室条件下，可以先采用等位基因特异性PCR进行检测，对可疑阳性患者再进一步选择灵敏度和准确度更高的ML-PA确定诊断。

本研究中对同一样本同时应用了这两种方法，目的是检测两种方法对于PMP22基因突变检查的一致性，指导临床建立基因筛查的程序。研究结果显示，在6例CMT患者和6例正常对照中，两种检查手段都得出了阴性结果，提示两种方法在检测结果上的一致性。但由于本研究样本数量较小，且缺少真正的短片段重复突变阳性结果，使得结论的说服性比较局限，故仍需扩大样本量以进一步证实。另外CMT涉及致病基因很多，其临床表型和基因类型缺乏一致性，阴性结果并不排除患者存在其他的基因异常，因此仍需要进一步基因检查以明确致病基因。

［1］Berger P，Young P，Suter U.Molecular cell biology of Charcot-Marie-Tooth disease［J］.Neurogenetics，2002，4(1):1-15.

［2］萧剑锋，唐北沙，夏家辉，等.聚合酶链反应技术在腓骨肌萎缩症基因诊断中的应用［J］.中华医学杂志，2001，81(3):138-141.

［3］Harding AE，Thomas PK.The clinical features of hereditary motor and sensory neutopathy typesⅠand Ⅱ［J］.Brain，1980，103(2):258-280.

［4］Lin KP，Chou CH，Lee HY，et al.Allele-specific all-or-none PCR product diagnostic strategy for Charcot-Marie-Tooth 1A andhereditary neuropathy with liability to pressure palsies［J］.J Chin Med Assoc，2006，69(2):68-73.

［5］林齐防，陈万金，王柠，吴志英，等.应用多重连接依赖性探针扩增定量技术检测假肥大型肌营养不良重复突变及携带状态［J］.中华神经科杂志，2011，44(10):568-573.

［6］张如旭，郭鹏，任志军，等.LITAF、RAB7、LMNA 和 MTMR2 基因在中国人腓骨肌萎缩症患者的突变分析［J］.遗传，2010，32(8):818.

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