P-AKT在非小细胞肺癌中的表达及意义

袁 莉 赵 辉 李 琳 王卫华

(菏泽医学专科学校药理学教研室，山东菏泽 274000)

肺癌在多数发达国家居恶性肿瘤首位，在我国多数大城市肺癌的发病率和死亡率也居恶性肿瘤的第一位或第二位，其中，80%为非小细胞肺癌(nonsmall cell lung carcinoma，NSCLC)。NSCLC的发生是由于正常细胞在基因水平失去了对其生长的有序调控，导致异常增生，是由多个原癌基因和抑癌基因共同参与的多基因、多步骤过程。有学者［1］提示PI3K/AKT通路参与NSCLC的发生和演进，在该通路上有很多因子发挥着不可替代的作用，如活化的AKT(P-AKT)，AKT于细胞内的激活(P-AKT)在NSCLC的一系列信号传导中起重要作用。本研究通过检测P-AKT在非小细胞肺癌和正常肺组织中的表达情况，分析P-AKT的表达及其与临床病理特征的关系，探讨P-AKT在NSCLC发生、发展中的作用及意义，为非小细胞肺癌的治疗及预后评估提供新的依据。

1 材料与方法

1．1 标本

标本来自内蒙古医学院第一附属医院2005年1月至2006年12月的非小细胞肺癌的存档石蜡标本66例，所有标本均有完整的临床资料，术前均未做放疗和化疗。其中，男性50例，女性16例，年龄范围28～77岁，中位年龄53岁，＞53岁49例，≤53岁17例。参照WHO肺肿瘤分类标准进行分类，按组织学类型分为腺癌24例，鳞癌42例;按分化程度分类，高中分化44例，低分化22例;≤2 cm 29例，＞2 cm 37例;根据有无淋巴结转移分为有转移组35例和无转移组31例;根据有无远处转移分为有转移组25例和无转移组41例。对照组为同期手术切除的炎性假瘤、支气管扩张病例并远离病灶2cm的正常肺组织共10例。

1．2 试剂

兔抗人P-AKT多克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司，工作浓度为1∶100);免疫组化Maxvision试剂盒、EDTA(乙二胺四乙酸)抗原修复液及DAB显色剂均来自福建迈新生物技术有限公司。

1．3 方法

采用免疫组织化学Maxvision二步法进行操作，步骤严格按照试剂盒说明书进行。已知阳性切片定为阳性对照，PBS代替一抗定为空白对照。

1．4 结果判断

P-AKT的阳性染色部位位于细胞质和细胞核。参考相关文献并作适当修改判断本研究的染色结果为［2］:随机选取5个高倍视野(×400)，每个视野记数100个癌细胞，计算阳性癌细胞数占总癌细胞数的百分比，阳细胞大于等于25%为阳性，小于25%为阴性。

1．5 统计分析

采用SPSS13．0统计软件进行数据处理，通过χ2检验比较NSCLC与正常肺组织中P-AKT的表达情况，按照临床病理特征对NSCLC组织进行分组并分析比较。

2 结果

2．1 P-AKT在NSCLC与正常肺组织中的表达情况

P-AKT在非小细胞肺癌和正常肺组织中的阳性率分别为 75．8%(50/66)、20．0%(2/10)。P-AKT在非小细胞肺癌中的表达显著高于正常肺组织，差异具有统计学意义(P＜0．05，图1～4)。

图1 P-AKT在正常支气管粘膜上皮中的表达染色部位以胞浆为主，部分核及核膜也着色(400×)

图2 P-AKT在高分化肺腺癌中的表达染色部位以胞浆为主，部分核及核膜也着色(400×)

图3 P-AKT在低分化肺腺癌中的表达染色部位以胞浆为主，部分核及核膜也着色(400×)

图4 P-AKT在高分化肺鳞癌中的表达染色部位以胞浆为主，部分核及核膜也着色(400×)

2．2 NSCLC中P-AKT与临床病理特征的关系

P-AKT在非小细胞肺癌中的阳性率为75．8%(50/66)，与癌组织的淋巴转移、远处转移及分化程度密切相关(P＜0．05)。在有无淋巴结转移组的非小细胞肺癌病例中，有转移的阳性率为88．6%(31/35)，明显高于无转移的阳性率61．3%(19/31)，两组差异有统计学意义(P＜0．05);在有无远处转移组的非小细胞肺癌病例中，M1的阳性率为96．0%(24/25)，明显高于 M0的阳性率63．4%(26/41)，两组间差异有统计学意义(P＜0．05);在不同分化程度的非小细胞肺癌病例中，高中分化组的阳性表达率为68．2%(30/44)，显著低于低分化组的阳性表达率90．9%(20/22)，两组差异有统计学意义(P＜0．05)。见表1。

表1 P-AKT与临床病理特征的关系

3 讨论

AKT是Staal SP等在研究逆转录病毒Akt8时发现在该逆转录病毒中含有一种细胞诱导的癌基因序列。AKT是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，为原癌基因，因其与致小鼠白血病病毒v-Akt高度同源而得名。AKT蛋白结构中N末端含PH功能域，该域大约由100个氨基酸组成，并与其它可结合PIP3的PH功能域存在高度相似性［3-4］。中部为催化活性区，C末端含调节活性区。AKT在PI3K(phosphoinositide 3-OH kinase，PI3K)和 PDK(3-phosphninosotidde-dependent protein kinase)的作用下发生磷酸化，其磷酸化位置位于调节结构域Ser473位点和催化结构域Thr308位点，AKT充分活化依赖于两个位点全部磷酸化［5］。PI3K/AKT信号传导通路发挥作用的关键在于AKT的完全活化(P-AKT)。活化后的AKT(p-AKT)主要在胞浆进行信号传导，这与本研究结果一致，P-AKT可磷酸化多种下游蛋白分子，如 BAD、FKHR、NF-KB、MDM2、GSK3β、mTOR等，通过对其下游的靶蛋白进行磷酸化而发挥其抗凋亡作用，参与NSCLC等多种恶性肿瘤的发生。

据研究表明，在乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胰腺癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤及甲状腺癌等癌组织中均有P-AKT的高表达。Kim等［6］通过构建甲状腺激素受体β基因表达突变的的鼠模型，来诱发甲状腺癌并使其发生远处转移，经免疫组化和共聚焦显微镜发现，在原发病灶和转移病灶中活化的AKT都有过表达，表明P-AKT参与甲状腺癌的发生发展，并与癌组织的转移有关。She QB等［7］研究发现在乳腺癌中PI3K的突变有选择性的依赖AKT发信号，由此证明在活体内直接抑制AKT可作为治疗乳腺癌和其他肿瘤的靶点，同时也表明AKT在该通路中扮演着重要角色，若可抑制AKT的活化，则可能对肿瘤的治疗有一定帮助，甚至阻止肿瘤的继续发展，这与Kallergi G的研究结果相似。在Kallergi G等［8］研究中:PI3K和p-AKT在乳腺癌早期和转移病变的循环肿瘤细胞中表达分别为88%和81%，总结得出，PI3K/AKT通路可以作为消除乳腺癌中循环肿瘤细胞的靶点。Hua K等［9］研究提出PI3K/AKT还参与卵巢癌的发生、发展、侵袭和转移。在本研究结果中，P-AKT在非小细胞肺癌和正常肺组织的阳性率分别为 75．8%(50/66)、20．0%(2/10)，与癌组织的淋巴转移、远处转移和分化程度有关(P＜0.05)，与汤建民等［10］的研究结果一致，汤建民等利用免疫组化SP法检测P-AKT在NSCLC和正常肺组织的表达情况，结果表明P-AKT在NSCLC中明显高表达，并与有无淋巴结转移和远处转移以及分化程度和临床分期有关，进一步说明，原癌基因AKT参与非小细胞肺癌的发展。

近年学者们研究认为P-AKT可促进细胞的生长增殖，抑制细胞的凋亡，由此促进肿瘤细胞的形成、恶性转化及侵袭转移。以上均提示，P-AKT可参与包括NSCLC在内的多种恶性肿瘤的发生和发展，检测P-AKT的表达情况有助于判断非小细胞肺癌的发生及发展程度，对其治疗有一定的指导意义。

［1］ 吴秋歌，王静．PI3K/AKT抑制剂对人肺癌细胞株生长的影响［J］．肿瘤基础与临床，2006，19(2):101-103．

［2］ 杨继要，王静，吴逸明，等．非小细胞肺癌组织中PTEN、P53蛋白的表达［J］．郑州大学学报，2005，40(6):1028-1031．

［3］ 林跃辉，王敏．PI3K/AKT信号转导途径与凋亡的关系［J］．国际病理科学与临床杂志，2005，25(4):307-310．

［4］ homas CC，Deak M，Alessi DR，et al．High-resolution structure of the pleckstrin homology domain of protein kinase B/AKt bound to phosphatidylinositol(3，4，5)-trisphosphate［J］．Curr Biol，2002，12(14):1256-1262．

［5］ 傅深，蒋国樑，刘泰富．PI3K/AKT生存信号转导通路在肿瘤放射生物学中的意义［J］．肿瘤，2006，26(3):298-301．

［6］ Kim CS，Vasko VV，Kato Y，et al．Akt activation promotes metastasis in a mouse model offollicular thyroid carcinoma［J］．Endocrinology，2005，146(6):4456-4463．

［7］ She QB，Chandarlapaty S，Ye Q，et al．Breast tumor cells with PI3K mutation or HER2 amplification are selectively addicted to Akt signaling［J］．PLOS ONE，2008，3(8):3065．

［8］ Kallergi G，Agelaki S，Kalykaki A，et al．Phosphorylated EGFR and PI3K/Akt signaling kinase are expressed in circulating tumor cells of breast cancer patients［J］．Breast Cancer Res，2008，10(5):80．

［9］ Hua K，Feng W，Cao Q，et al．Estrogen and progestin regulate metastasis through the PI3K/Akt pathway in human ovarian cancer［J］．Int Oncol，2008，33(5):959-67．

［10］ 汤建民，何权瀛，常秀君．磷酸化AKT蛋白表达在非小细胞肺癌中的临床意义［J］．中国呼吸与危重监护杂志，2005，4(3):193-197．