脂氧素A4对内毒素休克大鼠生存率及血浆炎性因子水平的影响

亓云法 许会彬 王克强

(1．泰山医学院附属医院检验科，山东泰安 271000;2．解放军第八十八医院检验科，山东泰安 271000)

内毒素休克是临床上常贝的危重病症之一，死亡率高达 30 ～60%［1，2］。常并发于感染、创伤、烧伤、放射损伤、失血性休克以及大手术等。其发病急骤，可累及多个器官，甚至可导致多器官功能障碍综合征(MODS)，而过度炎症反应是引起组织损伤和器官功能紊乱的重要原因。脂氧素A4(LXA4)作为一种内源性脂类介质，通过抑制中性粒细胞的趋化、黏附和炎性介质的释放等而具有广泛的抗炎作用，被称为是炎症反应的"刹车信号"［3］。

本实验通过LXA4预处理内毒素休克大鼠模型，观察大鼠血浆TNF－α、IL－10及丙二醛(MDA)的水平，初步探讨LXA4对内毒素休克的影响。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 动物模型及分组

雄性Wistar大鼠30只，体重(250±10)g(由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供)，随机分成生理盐水(NS)对照组(A组)、内毒素(LPS)休克组(B组)和LXA4干预组(C组)，每组10只。

1．1．2 主要试剂

脂氧素 A4(Lipoxin A4 methyl ester，美国 Cayman公司生产，溶于10%乙醇);大肠杆菌内毒素脂多糖(LPS，E．Coli 055:B5，美国Sigma公司生产);丙二醛(MDA)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒，TNF－α测定试剂盒、IL－10测定试剂盒(南京建成生物工程研究所产品)。

1．2 方法

1．2．1 模型制作方法参考文献［4］，LPS(大肠杆菌内毒素脂多糖，E．Coli 055:B5，美国Sigma公司生产)给予量为5mg/kg体重，LXA4［脂氧素 A4，Lipoxin A4 methyl ester，美国Cayman公司生产，溶于10%乙醇］给予量为0．1mg/kg体重。LXA4干预组:尾静脉注射LPS及LXA4;内毒素休克组:尾静脉注射LPS加与LXA4等量的10%乙醇;对照组:尾静脉注射等量生理盐水及10%乙醇。

1．2．2 样品采集

模型制成3h后，经颈动脉采血2．0 ml，置于肝素抗凝管，3000 r/min离心10 min，取血浆－30℃冻存待测。

1．3 大鼠存活时间监测

LPS注射后1h开始观察各组大鼠的生存情况，并记录死亡时间，总的观察时间为24 h。

1．4 炎性因子检测

分别采用ELISA方法检测血浆TNF－α、IL－10水平，硫代巴比妥酸法检测MDA含量，黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物岐化酶(SOD)活性。以上试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品，测定步骤完全按照试剂盒说明书。

1．5 统计学处理

采用SPSS 12．0统计软件包进行分析。计量资料以均数士标准差(±s)表示，多组间比较采用方差分析，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 存活时间比较

各组大鼠的存活时间如表1所示。对照组大鼠无一例死亡;内毒素组大鼠活动减少，蜷缩无力，口唇青紫，12h时的死亡率达100%，中位生存时间是9．16 h;而LXA4干预组大鼠存活时间均较内毒素组明显延长(log－rank检验，P ＜0．01)，12 h死亡率为20%，中位生存时间为16．25 h。表明LXA4能明显延长内毒素休克大鼠的存活时间。

表1 大鼠存活时间比较

2．2 血浆TNF－α、IL－10、MDA及SOD水平比较

与A组比较，B组血浆 TNF－α、IL－10及MDA水平显著升高(P＜0．01)，SOD水平明显下降(P＜0．01);C组血浆TNF－α、MDA水平较B组显著降低(P＜0．01)，IL－10及SOD水平明显上升(P ＜0．01)。结果见表2。

表2 血浆TNF－α、IL－10、MDA及SOD水平比较(±s)

表2 血浆TNF－α、IL－10、MDA及SOD水平比较(±s)

*表示A组 VS B组P＜0．01;#表示 B组 VS C组P＜0．01

组别(n=10) TNF－a(pg/mL) IL－10(pg/mL) MDA(mol/L) SOD(KU/L)A 组 38．26 ±9．17 34．16 ±7．39 4．57 ±0．81 355．06 ±39．23 B 组 114．51 ±28．49* 215．71 ±31．22* 7．72 ±1．35* 272．38 ±31．22*C 组 78．52 ±20．31# 261．03 ±23．92# 5．65 ±1．29# 328．56 ±44．59#

3 讨论

内毒素休克是严重创伤患者及临床危重病患者的一种常见并发症，也是引起多脏器功能衰竭甚至死亡的重要原因。内毒素休克病程进展可能涉及多种因素，包括炎症介质反应、炎症的级联反应、氧自由基的毒性、血管活性物质的作用以及微血栓形成等，而多脏器功能衰竭是全身性炎症反应综合征进展过程中的严重阶段，往往预后不良。因此，对内毒素休克救治措施的探讨一直倍受关注。

脂氧素(LX)是二十烷家族中一类花生四烯酸脂加氧酶代谢产物，LXA4是LX最主要的家族成员之一。LXA4在促炎介质前列素E2和白三烯之后产生，是目前所知体内重要的内源性促炎症消退介质。一方面，LXA4通过拮抗白三烯、抑制白细胞游走、黏附分子及趋化因子受体表达，抑制炎症反应的进一步恶化。另一方面，LXA4通过促进巨噬细胞对凋亡的中性粒细胞的吞噬，及时清除中性粒细胞，促进炎症消退［5，6］。

本研究应用LXA4对内毒素休克大鼠进行了干预并与休克组相比较，结果显示内毒素组大鼠活动减少，蜷缩无力，口唇青紫，12h时的死亡率达100%，中位生存时间是9．16 h;而LXA4干预组大鼠存活时间均较内毒素组明显延长，12h死亡率为20%，中位生存时间为16．25 h。表明LXA4能明显延长内毒素休克大鼠的存活时间。

肿瘤坏死因子－α(TNF－α)是由激活的单核－巨噬细胞产生的一种具有多种生物活性的多肽细胞因子，与机体免疫反应、急性期反应及炎症反应关系密切，它可通过激活细胞因子网络系统而诱发全身炎性反应。TNF－α是内毒素休克时最早释放且起关键作用的介质，是内毒素休克的重要起始因子，并在发展过程中起放大作用，即所谓的免疫炎症的瀑布反应，进而引起广泛的凝血，出现毛细血管渗漏综合征，使全身脱水和肺衰竭，导致全身性炎症反应综合征。IL－10主要由Th2细胞、活化的单核－巨噬细胞和上皮细胞产生，是一种重要的抗炎性细胞因子，能在转录和转录后水平上抑制前炎症因子的合成与释放，调节T细胞、B细胞、NK细胞、抗原提呈细胞、肥大细胞及粒细胞等免疫细胞的分化和增殖。体外实验研究显示，IL－10抑制TNF－α、IL－1、IL－6、IL－8等多种炎症介质的同时可上调可溶性TNF受体等抗炎物质，有利于重建体内炎症介质/抗炎介质的平衡。严重损伤和感染时，血液中不但有大量促炎介质，抗炎介质也大量释放。

本研究显示内毒素休克组血浆TNF－α、IL－10水平较对照组显著升高(P＜0．01);而LXA4组血浆TNF－α水平较休克组显著降低(P＜0．01)，IL－10水平明显上升(P＜0．01)。表明LXA4一方面可以抑制炎性介质TNF－α的产生，另一方面可以促进抗炎性介质IL－10的生成。

MDA是细胞膜脂质过氧化的最终分解产物，其含量的高低可反映机体细胞受自由基攻击的严重程度。脂质过氧化作用是在不饱和脂肪酸中发生的一系列自由基反应，它一方面使脂质含量较高的生物膜受到损伤，引起溶酶体颗粒崩溃，造成细胞死亡;另一方面使膜失去作为区域化的功能，导致按功能需要排列的酶紊乱。SOD则是氧自由基有效的清除剂，对机体的氧化与抗氧化平衡起着极其重要的作用。SOD是需氧生物体内的一种含不同金属离子的酶蛋白，其主要作用是清除体内有毒性的氧自由基，阻断由超氧阴离子自由基所激发的一系列自由基反应，有保护细胞免受自由基损害的作用［7］。因此，在机体灭活自由基的抗氧化体系中，SOD具有重要作用。SOD是机体内催化超氧阴离子自由基发生歧化反应的重要酶类，在防御炎症、化学中毒及肿瘤发生等方面起重要作用，而MDA是脂质过氧化的重要降解产物，可反映过氧化的过程。

本研究显示内毒素休克组血浆MDA水平较对照组显著升高(P＜0．01)，SOD水平明显下降(P＜0．01);LXA4组血浆MDA水平较B组显著降低(P＜0．01)，SOD 水平明显上升(P ＜0．01)。表明内毒素休克状态机体抗自由基能力减弱，不能产生足够的SOD，生物膜的损伤加剧，从而MDA含量增多。

综上所述，LXA4预处理可明显提高内毒素休克大鼠的存活时间，提高内毒素休克大鼠血浆抗炎性介质(IL－10、SOD)的水平，降低促炎性介质(TNF－α)的水平，对维持机体炎症介质/抗炎介质的平衡具有重要作用。

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