同型半胱氨酸对心肌细胞质量及蛋白质合成的影响

李素梅 刘 燕 冉张申 孙丽珍 郭军凤 李秀昌

(1泰山医学院校医院，山东泰安 271000;2泰山医学院附属医院，山东泰安 271000)

血清同型半胱氨酸水平升高已经被确定为心血管疾病的重要独立危险因素，血液中同型半胱氨酸水平增高可损害血管内皮功能，促进平滑肌细胞增殖，促进粥样斑块形成［1，2］。既往的研究中发现临床病人中血清同型半胱氨酸水平与左室心肌重量及左室心肌重量指数呈显著正相关，而且这种正相关独立于其他已知因素(如高血压、各种神经内分泌因素等)［3］，Wejksza等证明小鼠喂饲高半胱氨酸饮食诱发高同型半胱氨酸血症能诱导左室心肌重量增加［4］。国外有研究表明同型半胱氨酸能促进细胞外基质重构，增加心肌细胞内钙离子浓度［5］，因此血清同型半胱氨酸增高可能与心肌细胞肥大有关。同型半胱氨酸是否确能导致单个心肌细胞肥大，是否对心肌细胞蛋白质合成产生影响，尚有待进一步明确。本研究以培养的SD乳鼠心肌细胞为试验模型，观察同型半胱氨酸对心肌细胞质量和蛋白质合成的影响。

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

新生(24 h内)SD乳鼠购自山东农业大学实验动物中心。同型半胱氨酸、胰酶、胶原酶II购于美国 Sigma公司;DMEM、ITS 购自 Gibco公司;［3H］－Leu由中国原子能科学研究所提供;所用仪器主要包括日本三洋MCO－15AC型CO2培养箱，德国Beckman LS3810型液体闪烁仪，德国Leica2Q500心肌细胞图像分析系统等。

1．2 心肌细胞培养

取新生SD大鼠8只，参考Simpson等［6］的方法培养新生大鼠心肌细胞。简述之，超净工作环境下手术取出大鼠心脏，洗净血液剪去心房肌，将心室肌剪碎，采用0．08%胶原酶II+0．125%胰酶等比混合物消化后差速贴壁法去除非心肌细胞，将未贴壁细胞加入含150 ml/L胎牛血清、0．1 mmol/L 5－溴脱氧核苷的高糖DMEM 3ml培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养获得心肌细胞。

1．3 心肌细胞鉴定

常规倒置显微镜观察细胞形态、心肌细胞搏动情况，在倒置显微镜下观察到心肌细胞搏动频率＞100次/分，并经心肌肌钙蛋白－I染色阳性鉴定为心肌细胞。

1．4 蛋白含量测定

接种心肌细胞于24孔培养板(共两板，48孔)，每孔细胞计数1×105，48 h后换无血清培养液，24 h后实验组(共36孔，分为三组，每组12孔)分别加不同浓度同型半胱氨酸(0．1 mmol/L，0．5 mmol/L，1 mmol/l)继续培养24 h后，用0．25%胰蛋白酶消化细胞，PBS冲洗离心重悬细胞，充分裂解后，12000 r/min低温离心，采用Lowry法测定心肌细胞蛋白含量，根据每孔细胞数，计算出单个心肌细胞的蛋白质含量。

1．5 单个心肌细胞表面积测定

将贴壁生长的心肌细胞接种于6孔板中(共4板，24孔)，实验组(每组6孔)分别加入不同浓度的同型半胱氨酸(0．1 mmol/L，0．5 mmol/L，1 mmol/l)培养24 h，将培养的细胞用95%酒精固定后行HE染色，采用Leica2Q500心肌细胞图像分析系统测定心肌细胞表面积，每个视野测5～10个细胞，每张玻片随机取5个视野，取平均值。

1．6 心肌细胞蛋白合成速率测定

将培养的心肌细胞按3×108cells/L密度接种于24孔培养板(共两板，48孔)。48 h后换无血清培养液，24 h后实验组(共36孔，分为三组，每组12孔)分别加不同浓度同型半胱氨酸(0．1 mmol/L，0.5 mmol/L，1 mmol/l)继续培养18 h，然后均加入［3H］－ Leu(1 μl/ml)再培养6 h ，用 PBS洗去游离的同位素标记物，将细胞收集于玻璃纤维滤膜上，然后用100 g/L三氯乙酸冲洗和无水乙醇再冲洗，滤膜烘干后置于含4 ml闪烁液的液闪杯中，以液体闪烁仪测定每孔放射强度，均测量3次取平均值。

1．7 统计分析

2 结 果

2．1 同型半胱氨酸对心肌细胞蛋白质含量的影响

与对照组相比，经同型半胱氨酸作用后，单个心肌细胞蛋白质含量明显增加，不同浓度同型半胱氨酸实验组均明显高于对照组，而且随同型半胱氨酸浓度升高，单个心肌细胞质量也随之增加(见表1)。

2．2 同型半胱氨酸对心肌细胞表面积的影响

经同型半胱氨酸作用后，实验组单个心肌细胞表面积显著高于对照组，在不同浓度同型半胱氨酸作用的实验组中，单个心肌细胞表面积随同型半胱氨酸浓度升高而升高(见表1)，统计分析表明上述差异具有显著性。

表1 不同浓度的同型半胱氨酸对心肌细胞蛋白含量、表面积和蛋白质合成的影响

2．3 同型半胱氨酸对心肌细胞蛋白质合成速率的影响

以［3H］－Leu掺入量来评价同型半胱氨酸对心肌细胞蛋白合成速率的影响，与对照组相比，用同型半胱氨酸作用6 h后的心肌细胞［3H］－Leu掺入量显著高于对照组，而且在三组实验组中，心肌细胞蛋白质合成速率随同型半胱氨酸浓度升高而增高(见表1)，统计分析表明上述差异具有显著性。

3 讨 论

流行病学显示，心肌肥厚是心血管事件发生率、死亡率增加的重要独立危险因素及心脏性死亡的强有力的预测指标［7］。心肌细胞肥大、心脏成纤维细胞增殖及胶原合成是心肌肥厚的主要病理学基础。导致心肌肥厚的原因很多，包括负荷过重、神经－内分泌信号(如去甲肾上腺素)、代谢信号(如缺氧/缺血、活性氧)、心肌组织释放的局部激素及细胞因子等［8］，但这些仍不能完全解释心肌肥厚的原因。我们既往的临床研究表明，血清同型半胱氨酸水平与左室心肌质量及左室心肌重量指数呈显著正相关，而且这种正相关独立于其他已知因素(如高血压、各种神经内分泌因素)［4］，但同型半胱氨酸是否确能导致心肌细胞肥大和蛋白质合成增加仍未明确，本研究即在培养的心肌细胞中初步研究了同型半胱氨酸对心肌细胞肥大和蛋白质合成的影响。

同型半胱氨酸已被确定为动脉粥样硬化性心脏病的独立危险因素，研究表明同型半胱氨酸对血管平滑肌细胞及内皮细胞具有明显的促增殖效应［9］，也有研究表明型半胱氨酸能促进细胞外基质重构，增加心肌细胞内钙离子浓度［6］，而钙超载则是心肌细胞肥大的重要机制之一，因此同型半胱氨酸可能与心肌细胞肥大有关。我们的研究证明，经同型半胱氨酸作用的心肌细胞单个细胞蛋白质含量明显高于正常对照组，而且同型半胱氨酸对心肌细胞蛋白质含量的影响与同型半胱氨酸浓度成正相关，随着同型半胱氨酸浓度的升高，单个心肌细胞蛋白质含量也随之升高，这进一步证明了同型半胱氨酸能促进心肌细胞蛋白质的合成。

本研究证明在体外培养的心肌细胞中同型半胱氨酸还可导致单个心肌细胞表面积增加，表明同型半胱氨酸可促进心肌细胞体积增大，而且单个心肌细胞表面积与同型半胱氨酸浓度成正相关，说明同型半胱氨酸可能通过某种机制导致心肌细胞肥大，这可部分解释我们既往的研究中血清同型半胱氨酸水平与左室心肌重量呈显著正相关的结论［4］。

为评价不同浓度同型半胱氨酸对心肌细胞蛋白质合成速率的影响，我们采用［3H］－Leu掺入法测定了同型半胱氨酸对心肌细胞蛋白质合成速率的影响，结果显示经同型半胱氨酸作用的心肌细胞［3H］－Leu掺入量显著高于对照组，而且其掺入量与同型半胱氨酸浓度成正相关，说明同型半胱氨酸能促进心肌细胞蛋白质的合成速率，这可能是导致心肌细胞蛋白质含量增加和心肌细胞肥大的原因之一，但关于同型半胱氨酸促进蛋白质合成的机制尚有待于进一步研究。

综上所述，同型半胱氨酸在培养的心肌细胞中能促进蛋白质的合成，导致心肌细胞质量增加和细胞表面积增加，从而导致心肌细胞肥大。

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