慢性阻塞性肺疾病稳定期患者外周血Th17与Treg细胞表达及意义

石建邦，刘 辉，严 青，夏淮玲，徐晓玲

(1宣城市人民医院，安徽宣城242000;2安徽省立医院)

目前认为慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种由毒性气体或异常颗粒诱发，各种炎性细胞参与的全身炎症反应性疾病，吸烟为主要危险因素［1］。Th17细胞是近期发现的一种T细胞亚型，在慢性炎症和自身免疫性疾病中发挥重要作用;辅助性T细胞17(Th17)与CD+4CD+25Foxp3+调节性T细胞(Treg)细胞均来源于初始T细胞，Treg细胞是一类具有免疫抑制功能的T细胞亚群，而Th17细胞被认为是一种介导炎症反应的重要细胞［2］，两者在功能和分化过程中相互遏制，在正常机体内保持平衡，共同维持机体免疫平衡。为探讨Th17与Treg细胞在COPD发病机制中的作用及吸烟对其表达的影响，我们于2011年9月～2012年5月进行了如下研究。

1 资料与方法

1.1 临床资料 35例于2011年8月～2012年8月在我院体检中心健康查体者，依据吸烟史(吸烟量≥200支/年)分为健康不吸烟组(18例，A组)健康吸烟者(27例，B组);另选44例慢性阻塞性肺疾病稳定期患者(C组)，均有吸烟史。A组与B组纳入标准:①3个月内无呼吸系统疾病史且1个月内未使用任何药物;②年龄45～75岁;③肺功能检查正常;④无风湿免疫系统疾病、过敏性疾病及变态反应疾病;⑤签署知情同意书。C组纳入标准:①符合2007年修订版《慢性阻塞性肺疾病诊断指南》;②年龄45～75岁;③近半年内无急性加重史;④签署知情同意书。C组排除标准:①合并其他肺部疾病或有其他系统感染;②有风湿系统疾病或者免疫功能缺陷;③1个月内使用糖皮质激素;④有严重的其他系统疾病或恶性肿瘤。各组性别和年龄差异均无统计学意义，B组和C组吸烟量无统计学意义。本研究获得医院伦理委员会批准，并签署知情同意书。

1.2 相关指标检测 抽取各组清晨空腹静脉血8 mL，3 mL置于生化管(A管)、5 mL置于肝素抗凝管(B管)。A管高速离心收集血浆置于－80℃冻存待ELISA检测。用5 mL生理盐水稀释B管血液，无菌离心管中加入5 mL淋巴细胞分离液并将稀释的血液平铺在离心管中，室温下2 500 r/min离心30 min，然后吸取白膜层细胞置于另一无菌离心管中，再用10 mL生理盐水稀释白膜细胞，2 000 r/min离心20 min(重复2次)，收集离心细胞并用 RPMI 1640培养液(含10%胎牛血清、0.1 g/L链霉素和0.1 U/L青霉素)制成PBMC悬液，调整PBMC密度至2×106个/mL，其中2×106个用于流式细胞术检测Th17细胞。

1.2.1 外周血Th17与Treg细胞表达检测 采用FACS法。分别取PBMC 2×106个(1 mL)于2个无菌流式细胞管(B1、B2)中，B1用于检测Th17细胞，B2用于检测Treg细胞。①Th17细胞检测:B1管中加入 10 μL PMA(1 μg/mL)、10 μL 离子霉素(50 μg/mL)和1 mL 莫能菌素(2 μmol/mL)，混匀置培养箱中(37℃、5%CO2)培养5 h。取出细胞悬液用PBS洗涤离心，弃上清后加入5 μL抗人CD4-FITC单克隆抗体，振匀，避光孵育30 min;用2 mL固定破膜剂缓冲液洗涤2次，收集离心细胞并加入1 mL固定破膜剂工作液，4℃避光孵育30～60 min;用固定破膜剂缓冲液2 mL洗涤2次，加入5 μL PE标记的抗人IL-17抗体，振匀后置4℃避光孵育30 min;用PBS洗涤后弃上清并用1%多聚甲醛固定液(0.5 mL)固定待测;上流式细胞仪检测，以CD4直方图设门区分细胞，以散点图表示IL-17+细胞，用Cellquest软件获取并分析检测结果。②Treg细胞检测:B2管中加入5 μL抗人CD4-FITC和CD25-PE单克隆抗体、振匀，避光孵育30 min;用固定破膜剂缓冲液2 mL洗涤2次，收集离心细胞并加入1 mL固定破膜剂工作液，4℃避光孵育30～60 min;用固定破膜剂缓冲液2 mL洗涤2次，加入5 μL抗人Foxp3 PE-Cy5单克隆抗体，振匀后置4℃避光孵育30 min;用PBS洗涤后弃上清并用1%多聚甲醛固定液(0.5 mL)固定待测;上流式细胞仪检测，以 CD4、CD25设门区分细胞，再测定Foxp3+细胞。

1.2.2 外周血及PBMC培养液中IL-17水平检测将各组PBMC(2×106个，1 mL)加入24孔培养板内，每孔1 mL RPMI 1640培养液制成的细胞悬液，予以100 μL植物凝集素(0.4 g/L)于 37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h，收集上清置于－80℃冻存。取上述冻存血浆及PBMC培养上清液，采用ELISA法测定IL-17水平。严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.3 相关性分析 分析相关指标与吸烟年数及FEV1/FEV1预计值的关系。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行统计学分析。计量资料用¯x±s表示，多组均数比较采用方差分析，两两比较采用q检验;定性资料用χ2检验。P≤0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血Th17与Treg细胞表达 见表1。

2.2 外周血及PBMC培养液中IL-17水平 见表2。

2.3 相关性分析 B组:外周血Th17、Treg细胞与吸烟年数均呈正相关(r=0.782，P ＜0.01;r=0.421，P=0.029)。C组:外周血Th17细胞与吸烟年数呈正相关(r=0.409，P=0.009)，Treg 细胞与吸烟年数无相关性(r=0.032，P=0.834);外周血Th17细胞百分比与FEV1/FEV1预计值无相关性(r= －0.04，P=0.979);外周血及 PBMC 刺激培养液中IL-17水平与FEV1/FEV1预计值均呈负相关(r=-0.535，P ＜0.01;r= －0.393，P=0.008)。

表1 各组外周血Th17、Treg细胞比较(%，¯x±s)

表2 各组外周血及PBMC培养液中IL-17水平比较(pg/mL，¯x ±s)

3 讨论

研究证实，吸烟可诱导Th17细胞增殖和活化并高分泌IL-17，后者使气道上皮细胞和内皮细胞释放IL-6和IL-8等致炎因子和趋化因子，促使中性粒细胞和巨噬细胞募集到肺部炎症组织并分泌弹性蛋白酶破坏肺组织［3］;IL-6可强化Th17细胞的分化，且Th17细胞自分泌的IL-21能建立一个正反馈体系，并依赖核转录因子STAT3与IL-21启动子结合诱导Th17的进一步自身分化，维持微环境中Th17细胞的数量［4］。

初始CD+4T细胞在TGF-β和IL-6共同作用下分化为Th17细胞，Th17细胞通过分泌IL-17A、IL-17F、IL-21及IL-22在自身免疫性疾病和炎症性疾病中发挥着重要作用。IL-17在宿主防御和炎性疾病中起重要作用，连接着固有免疫和适应性免疫机制，其不仅能诱导上皮细胞、成纤维母细胞及内皮细胞分泌多种炎性因子和趋化因子，还能诱导中性粒细胞和巨噬细胞的聚集和活化，释放弹性蛋白酶、穿孔素及基质金属蛋白酶等破坏肺组织，促使COPD的发生和发展［5］。初始CD+4T细胞在TGF-β的单独诱导下分化为Treg细胞，且能分泌TGF-β、IL-10等细胞因子并表达Foxp3，在维护机体免疫平衡中发挥重要作用［6］。Treg按其起源可分为天然型(nTreg)、诱导型(iTreg)和Tr1细胞。Th17和Treg细胞在机体免疫和疾病发生中起着截然不同的作用。Th17细胞主要通过分泌细胞因子促进中性粒细胞的动员、募集和活化，介导促炎反应;Treg细胞的免疫抑制作用在保持机体的免疫耐受性中发挥着决定性作用，其数量及功能异常与自身免疫性疾病、慢性炎症反应及肿瘤的发生有密切关系。

本研究B组及C组外周血及外周血刺激培养液中IL-17水平均明显高于A组，C组又明显高于B组，表明香烟烟雾参与了Th17细胞的活化，可上调Th17细胞的数量或功能。研究表明长期暴露于香烟烟雾的小鼠和人的肺组织内IL-17含量明显升高［7，8］。吸烟可诱导 Th17细胞的增殖和活化并高分泌IL-17，使气道上皮细胞和内皮细胞释放IL-6和IL-8等致炎因子和趋化因子，促使中性粒细胞和巨噬细胞募集到肺部炎症组织并分泌弹性蛋白酶破坏肺组织［9］。本研究 COPD稳定期患者外周血Th17和IL-17水平及PBMC培养液中IL-17水平高于健康吸烟者和健康不吸烟者，表明Th17和IL-17过度表达和功能活化可能促使了COPD的发生;Th17细胞始终参与吸烟所致的全身性异常炎症反应，在吸烟肺功能正常者发展到COPD这一连续的炎症反应中发挥强大的促炎作用，健康吸烟者可能处于向COPD发展的危险阶段，此与相关研究结果基本一致［10，12］。本研究C组外周血Th17细胞百分比与FEV1/FEV1预计值无相关性，而外周血和PBMC培养液中IL-17水平与FEV1/FEV1预计值呈负相关，提示外周血Th17细胞百分比与气流受限程度明显相关，而外周血和PBMC培养液中IL-17水平与气流受限程度有关，表明气流受限程度不同的COPD稳定期患者中Th17细胞活性可能存在差异。本研究相关性分析表明，B、C组外周血Th17细胞均与吸烟年数有关，表明香烟烟雾参与了Th17细胞活化，可上调Th17细胞数量。

Treg细胞在体内通过抑制体内免疫炎症反应维持机体免疫平衡，故理论上COPD患者体内Treg细胞的数量应该减少。Smyth等［13］研究提示，健康吸烟者和COPD患者肺泡灌洗液中CD+4CD+25T细胞的数量明显高于健康不吸烟者。本研究B组和C组外周血中Treg细胞水平均明显高于A组，C组明显高于B组，与Maria等［10］的研究结果一致。提示在健康吸烟者逐渐发展为COPD的过程中Treg细胞逐渐失去调节功能，使得机体免疫调节功能降低;同时激活体内反馈调节系统，促使Treg细胞数量增加，与相关研究结果相符［14］。

综上所述，COPD稳定期患者外周血Th17、Treg细胞和IL-17水平明显升高;Th17细胞百分比与气流受限程度无关，但细胞活性可能与气流受限程度有关;吸烟能够促使Th17细胞增殖和活化，从而促使Treg细胞水平升高，可能影响Treg细胞的功能。COPD中全身的异常炎症反应在疾病开始时期即肺功能正常吸烟阶段已经存在，健康吸烟者随着全身异常炎症反应的放大，Th17和Treg之间平衡失调，最后发展为COPD，但由于个体易感性不同，只有部分吸烟者发展为COPD。本研究为进一步研究Th17和Treg细胞在COPD发病机制中的作用提供了理论基础和实验数据，对COPD治疗方法的选择和疗效评价有指导意义。

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