原料药发酵车间工程设计关键要素分析

李向科 姚雪坤

（1.中核第四研究设计工程有限公司，石家庄 050021；2.石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司，石家庄 050035）

传统发酵[1]指利用自然界存在的微生物或用传统方法（如：辐照或化学诱变）改良的微生物来生产原料药的工艺。用“传统发酵”生产的原料药通常是小分子产品，如：抗生素、氨基酸、维生素和糖类。

传统发酵原料药工程发酵车间的一般工艺流程为：

原料药发酵车间在工程设计中要从车间布局、种子制备、发酵罐、接种方式、补料、压缩空气系统及排气系统等方面抓住一些关键要素，才能使后续的生产更加符合技术先进、节能环保的新要求。

1 车间布局

大中型发酵车间一般为三层框架结构建筑物，生产的火灾危险性类别一般为丁类。按照功能可分为配料区、种子及发酵罐区、补料消毒罐区、种子制备区、霉菌及化验区以及其它辅助区域。

1.1 布局原则

在满足安全、卫生等规范要求下，充分考虑如下几点：

（1）设备布置按照工艺流程要求，充分考虑厂房内物料的联系，并结合辅助厂房的位置，力求线路最短，物料走向流畅。

（2）设备布置尽量按工艺流程顺序分区，生产类别相同的区域集中布置，以便管理。

（3）厂区和车间内的动力设施靠近负荷中心布置，以减少能耗。

1.2 垂直布局

发酵车间各层层高的确定应遵循的原则：以发酵罐的高度确定三层楼板的标高，以二级种子罐的高度确定二层楼板的标高，以发酵罐的电机和检修行车高度确定车间的总高。

车间各层高度按原则初步确定后，还应进一步核实层高是否与补料消毒罐、配料罐以及液体贮罐等其它较大设备的高度相适宜；另外，主管廊和大管道的安装也要考虑；如果层高不合适，可以通过微调发酵罐、种子罐或其它罐体的高径比来调整。

所有罐体上封头和操作面在三层。另外，考虑到发酵车间一般湿热蒸汽较多，发酵罐区域经常设天窗用于车间通风。发酵车间一般垂直布置示意图见图1。

1.3 平面布局

发酵车间三层为主要操作面，除了种子罐、发酵罐和补料消毒罐区域外，还应设有控制室、变频器室、种子组和值班室等辅助房间。控制室应设在视野开阔的区域，并开设大窗，便于观察生产区的情况；变频器室用于放置发酵罐为了节能和控制的需要而设置的变频系统。

发酵罐的取样口一般设在车间二层，因此，霉菌室和化验室宜设置在该层。为充分利用厂房空间，配料区一般布置在位于种子罐垂直方位下方的一层区域。发酵车间一般平面布置图见图2。

2 种子组及霉菌化验

2.1 种子组

工作菌种的种子制备一般包括两个过程，即将砂土孢子或冷冻孢子在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备过程和在液体培养基中生产大量菌丝的种子制备过程。前者是在种子组完成的；后者是通过种子罐扩大培养完成的。

种子组一般包括：菌种间、培养基准备间、清洗消毒间、接种间、培养间或恒温室等房间。按照《药品生产质量管理规范》（GMP）的要求，培养基准备间和清洗消毒间可在一般环境下进行；接种间在C级洁净环境下设置层流工作台完成接种操作；菌种间、培养间可在D 级洁净环境或恒温恒室环境。种子组一般平面布置见图2。

2.2 霉菌化验

霉菌化验区域主要负责生产过程中所取发酵液样品的菌丝形态、菌浓、杂菌、有效成分效价、糖氮含量等指标的分析测定。

图1 发酵车间一般垂直布置示意图

图2 发酵车间一般平面布置示意图

霉菌区一般包括：准备间、清洗消毒间、接种间和恒温室；化验区一般包括：生测室、仪器室、天平室、镜检室和高温间等。按照GMP的要求，准备间、清洗消毒间和化验区可在一般环境下进行；接种间需在D 级洁净环境下设置层流工作台完成接种操作；恒温室可在D 级洁净环境或恒温恒室环境。霉菌化验区域一般平面布置见图2。

3 发酵罐

3.1 罐体

3.1.1 罐体结构要点

根据菌种生理特性和培养基性质，发酵可分为厌氧固体发酵、厌氧液体发酵、好氧固体发酵及好氧液体发酵。传统发酵原料药大多属于好氧液体发酵。

好氧液体发酵罐的结构要点是：

（1）适宜的高径比

一般情况下，发酵罐的高径比（H/D）一般取1.8～2.8，常用的为2～2.5。对于细菌发酵罐来说，高径比宜为2.2～2.5；对于放线菌发酵罐高径比宜为1.8～2.2。容积较小时，高径比宜取上限，容积较大时宜取偏下限[2]。

（2）能够承受一定的压力

发酵罐除了要维持正常培养的罐压，还要承受设备及培养基灭菌时的蒸汽压力，一般为压力容器。

（3）合理的通气搅拌方式

要使通入罐内的无菌空气均匀分布，加强气液接触效果，提高氧的利用率；保证发酵液充分混合，料液浓度均一。

（4）足够的换热面积

发酵培养基的加热、灭菌、冷却，以及培养过程中发酵热的及时移除，都要求设备有足够的换热面积。

（5）无菌效果的保证

发酵罐材质一般为不锈钢，内壁有光洁度要求。罐体内件尽量减少死角，搅拌装置要有严密的轴封，防止泄漏，以保证设备能够灭菌彻底。

应用较广泛的好氧液体发酵设备主要分为以下两类：

（1）机械搅拌通气式发酵罐

机械搅拌通气式发酵罐电机一般采用380V 无级调速电机，配合低压变频器，实现电机的无级调速，目前也有一些发酵产品使用690V 或10kV 电机。变频器可使发酵罐电机降低启动电流，保证电机的安全启动，生产过程中还可根据发酵进程调整电机转速，在保证发酵生产工艺需求的前提下尽量节省能耗。

由于电机转速一般高于搅拌转速，因此，必须通过减速机降速。常用的减速机有皮带传动和齿轮传动两种类型。搅拌轴常用机械密封型式，密封可靠，易灭菌彻底。

机械搅拌通气式发酵罐能够保证无菌空气与发酵液充分混合，提高发酵液溶氧量，利于传热，特别适合通气比要求较高、发热量大的发酵反应；但其内部结构较为复杂，操作要求较高，而且机械搅拌对于丝状细胞的培养发酵有不利影响。

（2）气升式发酵罐

气升式发酵罐属于非机械搅拌发酵罐，以气体搅拌代替了传统的机械搅拌。罐内设有导流筒，罐底高速喷入的气流在导流筒内外形成发酵液密度差，从而产生压力差，使发酵液在罐内循环流动。

气升式发酵罐节省动力，降低了产品成本，设备投资比机械搅拌发酵罐约能降低30%；结构简单，装料系数高，设备内死区较少，而且没有动密封装置，无泄漏，无菌操作可靠性大大提高；气升式发酵罐以气体为动力，既能使发酵液混合均匀，又没有机械剪切力，特别适合于动植物细胞、维生素C的培养；但是对于黏度较大的发酵液溶氧率较低，不适合固形物含量高、黏度大的发酵液。

图3 机械搅拌通气式发酵罐

3.1.2 罐体容积计算

发酵罐容积可按下式计算：

式中：V1—发酵罐公称容积（m3）；

G — 生产规模（t/a）；

Up— 成品效价（U/mg）；

Um— 发酵单位（U/mL）；

λ — 染菌率（%）；

y — 总收率（%）；

A —年工作日（d/a）；

η1— 发酵罐装料系数（%）；

n — 每天放罐数量（台/d），根据每天放罐体积与发酵周期综合考虑。

种子罐容积可按下式计算：

式中：V2— 种子罐公称容积（m3）；

α1— 发酵罐接种比（%）；

V1— 发酵罐公称容积（m3）；

η1— 发酵罐装料系数（%）；

η2— 种子罐装料系数（%）。

综合考虑各个因素，取定高径比，就可得出发酵罐和种子罐的外形尺寸及全容积。

图4 气升式发酵罐

3.2 灭菌方式

液体培养基的灭菌方式主要有分批灭菌法和连续灭菌法[3]。

3.2.1 分批灭菌

分批灭菌也称实罐灭菌或实消（以下简称实消），指将配制好的培养基全部输送至发酵反应器后，通入蒸汽直接加热，再冷却至接种温度的灭菌过程。实消一般控制罐温在119℃～121℃，罐压维持在0.09 MPa～0.1MPa（表压）后，保温30min 左右。

实消无需其他灭菌设备，操作简单，染菌机会少，对蒸汽稳定性的要求较低，一般在0.3 MPa～0.4MPa（表压）就可满足要求。但是实消灭菌时发酵罐不能用于发酵生产，设备利用率较低；灭菌时间长，培养基的营养成分由于过热易遭到破坏，易产生糊化等现象。这些优缺点决定了实消主要适用于小型发酵罐或种子罐的培养基以及容易产生泡沫的培养基的灭菌。

3.2.2 连续灭菌

连续灭菌也称连消，指将培养基在发酵反应器外，通过专门灭菌装置，连续在不同设备中分别进行加热、维持保温和冷却，然后进入发酵反应器的灭菌过程。

连消的灭菌温度多在130℃～140℃。培养基由泵打进加热器，在15s～30s 之内被快速加热至灭菌温度，进入维持器维持5min～8min，然后在冷却器中冷却至40℃～50℃，最后输送至已灭菌的发酵反应器中。由于连消系统要求连消泵出口压力在0.6MPa（表压）左右，所以，蒸汽压力要求达到0.5MPa～0.6 MPa（表压）以上，以使两者压力接近，满足培养基流速均匀稳定的要求，避免因流速波动影响灭菌的质量。

连消主要用于大规模发酵生产的液体培养基的灭菌，已在维生素C、谷氨酸等工业中广泛应用。另外，由于糖和氮源物质在高温下会发生美拉德反应而变质，在7-ACA、红霉素等发酵生产过程中，把葡萄糖和氮源分开灭菌，葡萄糖单独进行连消后送入发酵罐。

3.3 循环水冷却方式

3.3.1 循环水种类选择

发酵车间冷却循环水用于发酵罐、种子罐及补料罐培养基灭菌后的降温，以及培养过程中发酵热的移除，分为循环水和制冷水。

根据发酵过程温度控制要求和一年四季循环水温度的变化，冷却循环水的一般选择原则为：当循环水温度低于18℃时，消后降温和发酵过程温度控制全部使用循环水；当循环水温度高于18℃时，发酵过程温度控制全部使用制冷水，消后降温的高温段（121℃～60℃）使用循环水，低温段（60℃～30℃）冷却使用制冷水。

3.3.2 消后降温过程

连续灭菌的消后降温多为换热器间接换热过程，属稳态传热；冷却循环水平均温升一般控制在10℃～20℃。

分批灭菌的消后降温属非稳态传热；一般控制高温段（121℃～60℃）降温时间约1h～1.5h。冷却循环水平均温升一般在20℃～30℃。

3.3.3 发酵培养过程

发酵培养过程中通过温度计测得的信号，经自动控制系统，反馈调节循环水管道系统的气动阀门，实现冷却循环水流量的自动控制，从而维持罐温的稳定。

4 接种方式

4.1 一级种子罐

接种是发酵过程中逐级扩大培养的前提，如何保证接种过程的无菌性是关键。一级种子罐所用种子是在种子组里经摇瓶培养完成的。

一级种子罐的接种在生产现场进行。受接种量和摇瓶等设备的限制，无法实现在线无菌管道接种；因此常采用以下接种方式[4]：

4.1.1 火焰保护接种法

火焰保护接种法适用性较强，既适用于摇瓶种子（种子带有菌丝）或米孢子或斜面种子（种子有孢子颗粒）的种子接种，也适用于孢子悬浮液接种。接种时，打开盖帽，在接种口圆盘或另设的圆环盘上加酒精点燃，对接种口周围的空气进行消毒，种子液则在酒精火焰的保护下倒入一级种子罐。火焰保护接种法接种管口如图5所示。

图5 火焰保护接种法接种管口结构

4.1.2 微孔压差接种法

微孔压差接种法主要适用于种子液为悬浮液，不含孢子颗粒和菌丝的情况，接种时将接种口上的接种帽或胶布揭开，用酒精等试剂对瓶塞（可用胶塞或丁基塞）进行擦拭消毒后接种，接种量较小时可采用大号注射器注射接种，接种量较大时可采用蠕动泵接种。微孔压差接种法接种管口如图6所示。

图6 微孔压差接种法接种管口结构

4.1.3 无菌车接种法

随着空调洁净技术的发展，无菌车是在生产过程中新发展的一种比较成熟的技术；将一个自带风机和高效过滤器的移动无菌车，在接种时推到接种口附近，利用A 级层流使接种口周围空间达到无菌状态，再进行接种。此法适用于各种类型种子的接种，特别适用于接种量较大的场合；接种口既可以是种子罐上专用的接种口，也可以利用设备上的手孔或人孔兼作接种口，但对无菌车与罐体对接的密封性要求较高。无菌车接种法如图7所示。

图7 无菌车接种法示意图

4.2 二级种子罐和发酵罐

二级种子罐和发酵罐是通过灭菌后的接种管道，利用压差法实现现场在线无菌移种操作的。根据操作方式，接种管道可分为公用管道和接种站两种方式。

4.2.1 公用管道

公用管道移种是利用一根总管将一级种子罐和二级种子罐，或二级种子罐和发酵罐连接在一起进行移种操作。平时没有移种操作时，总管处于汽封状态。公用管道移种流程如图8所示。

图8 公用管道移种流程

公用管道移种方式总管较长，但各个支管较短，管道总用量较少，车间管道布置也简单；但是非端头罐体移种时种子液易存留在总管中，造成种子液的浪费；各个阀门相距较远，人员走动较多，操作不很方便；在进行灭菌操作时，所有支管根部与总管连接处易形成存料死角，若支管根部均设小排气阀，则车间易有蒸汽弥漫现象。

4.2.2 接种站

接种站移种是将罐与罐之间的移种阀门集中在一起，各个移种支管均连接在一段较短的母管上进行移种操作。平时没有移种操作时，母管处于汽封状态。接种站移种流程如图9所示。

图9 接种站移种流程

接种站实现了移种的集中操作，减少了人员走动，操作更加方便；母管较短，种子液很少浪费，灭菌效果比较可靠；但每根支管都比较长，管道总用量较大，管道布置较为复杂，占用空间较多；接种站所有阀门应装在母管上方，否则支管根部易存留种子液，造成污染。

接种管道阀门常选用带小排气阀的抗生素阀，或使用金属阀体的隔膜阀，通过在底部打孔安装小排气阀实现无死角操作。另外，目前常在移种管道各个分支处使用三通隔膜阀或三通抗生素阀，这样能较好解决支管根部死角的问题。

图10 移种管道常用阀门

5 补料系统

5.1 补料管道系统

补料管道与移种管道类似，也可根据操作方式的不同，分为公用管道和补料分配站两种方式。因为正常情况下补料系统管道内是一直充满无菌物料的，所以补料系统总管或母管上不用专设灭菌蒸汽管道。补料系统一般隔一段时间利用补料罐底蒸汽大消一次，在管道末端设有排气阀，保证灭菌时无死角，从而满足补料系统的整体无菌要求。

图11 公用管道补料流程

5.2 自动化补料执行机构

发酵罐流加补料系统一般通过自动化控制系统，在发酵培养周期内定时定量控制补料量。

流加补料系统采用专用的补料执行机构，该机构由具有耐酸碱、耐高温消毒、不染菌、可靠性高等特点的入料开关阀、出料开关阀和计量罐组成。补料方式为由操作员在计算机上设置补料速率（如糖、油等的补料速率），计算机根据补料速率自动计算并转化为等间隔的时间，完成入料、出料等一系列相关动作。补料执行机构示意图图12。

图12 补料执行机构示意图

图13 现场补料架安装图

补料执行机构常用计量罐方式进行物料的计量，也有采用气动阀门加流量计方式的。

大多数发酵生产过程是一个产酸过程，一般通过流加碱性物质，如氨水、液碱等来调节发酵液的pH 值。所加碱性物质经计量后通过进罐空气管道压入罐中，经过压缩空气的喷射作用，可以更均匀的分布到发酵液中。

6 压缩空气系统

根据发酵对压缩空气质量的要求，发酵用压缩空气制备工艺流程如下：

大气→空气过滤器→离心式空气压缩机（含中间冷却器）→末冷却器（除水去湿）→气水分离器→厂区压缩空气管线→空气加热器→工艺用气点前过滤器→工艺用气点

发酵用压缩空气的制备常在专门的空压站内进行。空气加热器安装在发酵车间压缩空气入口处。

6.1 常用规格

压力：0.22 MPa（表压）～0.3MPa（表压）；

相对湿度：<60%；

最大粒子尺寸：≤1.0µm；

最大含油量：≤0.01mg/m3；

温度：40℃。

从空压机出来的供发酵用压缩空气，压力一般为0.22MPa（表压）～0.3MPa（表压），经过末级冷却后，可认为是20℃的饱和湿空气，进发酵车间之前一般要用0.3MPa（表压）～0.6MPa（表压）的饱和水蒸汽加热，以降低压缩空气的相对湿度（一般要求小于60%），有利于过滤除菌。

空气加热器常用套管式和翅片式换热器。套管式换热器结构简单，不易结垢，有利于发酵用压缩空气的洁净要求，但传热系数较小，所需换热面积较大，设备也较大；翅片式换热器，相同换热面积下设备体积较小，内部结构复杂，空气阻力损失较大。

6.2 压力确定

发酵用压缩空气的压力根据培养罐压、液位高度、过滤器（初效过滤、预过滤、精过率）压降、空气加热器压降、空压站设备以及厂区输送管路的压降以及一定的富余量确定。

p=p罐+p位+p初+p预+p精+p加热器压降+p其它压降+△p

6.3 用量

好氧发酵时发酵罐的通气比常在（0.8～2）V/V/min，视品种而定。

Vm=γ·V1·η1

式中：Vm— 发酵罐压缩空气通气量（Nm3/min）；

γ — 标准状态下发酵罐的通气比（V/V/min），一般取0.8～2；

V1— 发酵罐公称容积（m3）；

η1— 发酵罐装料系数（%），一般取75%～80%。

7 排气系统

7.1 排气流程

发酵排气分为消毒排气和培养排气。

消毒排气主要是在实消或空消时，满足灭菌压力要求后排掉的水蒸汽。另外，可能含有微量的培养基成分。

培养排气主要是发酵培养过程的排气。

传统做法是发酵排气经旋风分离器气液分离后，液相经沉淀收集池打入污水处理设施，气相认为已满足环保要求，经旋风分离器的排气口高空排放。

旋风分离器在发酵排气系统中应用很广泛。能够较好的将发酵排气进行气液分离。旋风分离器进口气速保持在10m/s～25m/s 范围内为宜[5～6]。

7.2 尾气处理装置

在环保要求越来越高的今天，传统的排气流程也要逐渐改进。

微生物发酵过程中，需要通入大量的无菌空气以提供微生物氧化消耗和带走生长代谢过程中产生的少量二氧化碳、极少量的代谢废气和特有的异味气体，另外，不可避免的会带出微量发酵液成分。除氮气和氧气外，这些气体大都是可溶于水的。将排气收集后通过吸收装置，能有效减少异味气体的排放，减少对环境的污染。

常见的发酵尾气处理流程如图14所示。

图14 发酵尾气处理流程

根据排气量和有害成分处理的难易程度，也可将气体吸收装置延伸为两级。较常见的吸收装置是喷淋塔，流程简单，操作方便，只要根据发酵排气性质选定吸收剂即可，但这种方法废水量较大。

目前已有一些尾气处理设备厂家开始研究活性炭吸附、低温等离子催化以及光催化氧化等技术在发酵尾气排放中的应用。此项技术的最大难点在于，一般的发酵排气量都比较大，从每分钟几百立方米到几千立方米都有，而且发酵排气压力一般较低，表压在0.05 MPa～0.08 MPa，对设备的处理能力和动力要求较高。

8 结论

根据前文所述，可以得知传统发酵原料药工程发酵车间的一般特点：

（1）设备种类较多，为避免无菌物料染菌，对设备材质、内部抛光度等要求较高。

（2）工艺流程比较复杂，关键点的自动化程度较高。

（3）管道布置要求较高，管道穿越楼层较多；阀门及管件的选择和设置要尽量减少死角与盲管。

（4）能耗较高，蒸汽、冷却循环水、压缩空气及电等公用工程用量较大。

（5）产生废水、废气较多，需经污水处理和洗气处理之后再排放。

基于以上特点，在原料药发酵车间工程设计中要合理确定车间布局，充分考虑发酵罐型式、管道布置、公用工程及三废等各方面的细节要求，以减少物料染菌风险，提高劳动效率，降低生产能耗。

[1]中华人民共和国卫生部.药品生产质量管理规范（2010年修订），附录2，第四十九条.

[2]中国石化集团上海工程有限公司.化工工艺设计手册.（第四版，上册）[M].北京：化学工业出版社，2012,387.

[3]李向科,等.抗生素发酵液体培养基的灭菌动力学及工艺研究[J].医药工程设计，2013,34(1):8-16.

[4]高朋杰.生物发酵生产中一级种子罐接种方式设计[J].工程勘察设计与监理，2010,31(4):17-20.

[5]姚玉英.化工原理.（上册）[M].天津：天津大学出版社，1999，152.

[6]俞俊棠.抗生素生产设备[M].北京：化学工业出版社，1982,61-77.