模拟深埋条件下持续性挤压伤复合低氧缺水缺食大鼠肺脏的功能和病理变化

刘志瑞，王德文，左红艳，王少霞，郭晓明，王静雯，曹桓荣

模拟深埋条件下持续性挤压伤复合低氧缺水缺食大鼠肺脏的功能和病理变化

刘志瑞，王德文，左红艳，王少霞，郭晓明，王静雯，曹桓荣

目的：研究模拟深埋条件下持续性挤压伤复合低氧缺水缺食大鼠的生命耐受力、肺脏功能及病理变化特点。方法：应用Wistar雄性大鼠144只，随机分为正常对照组、单纯挤压伤组、低氧缺水缺食组（三缺组）、挤压伤复合低氧缺水缺食组（复合组），采用钳夹双后肢近端方法建立挤压伤模型，压力设置（4.5±0.3）kg，于致伤后第1天、第3天、第5天、第7天、第9天、第11天检测大鼠动脉血气参数（PaCO2、PaO2），切取肺脏，常规制片，光镜和电镜观察，Tunel法检测肺脏细胞凋亡，SP法检测凋亡相关因子Bax和炎性因子TNF-α。结果：1.复合组大鼠于伤后第7天内全部死亡，三缺组于第11天内全部死亡，单纯挤压伤组和正常对照组未死亡。2.三缺组和复合组血PaCO2和PaO2值呈急剧持续性显著降低至死亡；单纯挤压伤组PaCO2轻度升高、PaO2呈下降趋势。3.复合组肺脏指数增高，以充血、血停滞、点灶状出血、轻度到中度水肿等血循环障碍为主，并有数量不等的血栓（红血栓，弥散性血管内凝血）形成和小叶局灶性间质性肺炎样改变，从第4天直到第7天时血循环障碍则明显加重，三缺组和单纯挤压伤组依次减轻。结论：挤压伤复合低氧缺水缺食大鼠肺脏功能和结构发生明显损伤，具有高发性、进行性、全肺性特点，提示肺脏是加重复合性挤压伤并发多器官功能障碍衰竭，促进死亡的重要远隔脏器之一。

模拟深埋条件；复合性挤压伤；大鼠；肺脏；持续挤压

[Key Worrds]simulant deeply buried condition；combined crush injury；rat；lung；continuous crush由于地震灾害、人为劣质工程以及事故等可造成房屋建筑垮塌，人员被掩埋，掩埋在深层废墟内的人员易受到挤压伤及缺氧缺水缺食等影响。肢体挤压伤会对机体产生广泛而复杂的影响。这种广泛的软组织（主要是肌肉组织）损伤是以双下肢及臀部损伤为主，其损伤特点是不仅造成挤压肢体横纹肌严重坏死溶解，而且导致大量肌红蛋白释放入血，继发性引起全身性多脏器的病理损伤和多器官功能衰竭，其中尤以肾脏损伤为突出，迄今已对上述规律和特点进行了大量研究。肺脏虽是其远隔损伤器官之一，但关于挤压伤时肺脏的研究极少（近10年国内仅见2篇[1-2]，国外则未见报道），国内外更未见关于掩埋条件下挤压伤复合缺氧缺水缺食对人员肺脏影响的研究资料。基于肺脏是机体呼吸系统的主要器官，本研究立足于模拟灾害性掩埋条件，探讨挤压伤复合低氧缺水缺食对大鼠肺脏结构与功能的损伤规律、特点及其部分机制，其结果对揭示挤压伤复合低氧缺水缺食所致多器官衰竭，而致机体死亡过程中肺脏所起的作用及其现场救治提供一定的参考依据。

1 资料和方法

1.1 实验动物及分组 选用健康同龄雄性Wistar大鼠144只，体重（220±20）g，随机分为正常对照组（27只），单纯挤压伤组（36只），低氧缺水缺食组（三缺组39只），挤压伤复合低氧缺水缺食组（复合组42只）。

1.2 模型制作方法 挤压伤复合低氧缺水缺食大鼠采用同时钳夹双后肢近端方法建立挤压伤模型，压力设置（4.5±0.3）kg，建模后与三缺组大鼠同时置入低氧生物医学实验舱内，将舱内氧气浓度维持在（10±0.1）%，禁食水，连续挤压，处于低氧环境，持续观察至第11天全部死亡，同时，利用监控仪及工作人员定时进入舱内观察大鼠在舱内的情况。单纯挤压伤组大鼠采用同样钳夹双后肢近端的方法建立挤压伤模型，可自由进食水。正常对照组未予任何处置。

1.3 动脉血气分析 大鼠于挤压伤后第1天、第3天、第5天和第7天，腹腔注射1%戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉后，动脉采血针经腹主动脉采血，ABL77血气分析仪（Radiometer Copenhagen公司）分析PaCO2、PaO2。每组大鼠6只。

1.4 光镜病理组织学标本 取第1天、第3天、第5天、第7天、第9天和第11天肺脏组织，每组6只，经10%缓冲福尔马林固定1周后，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，4μm厚制片，60℃温箱烤片1周。常规HE染色，光镜（DM3000，莱卡公司）观察并照相。

1.5 电镜超微结构标本 取复合组和对照组第7天肺脏组织1 mm3，立即置入2.5%戊二醛内固定，1%锇酸固定2 h，梯度乙醇和丙酮脱水，Epon812包埋，半薄切片定位后，制作超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，Philip-CM120型透射电镜（TEM，飞利浦公司）观察并照相。

1.6 原位末端标记法（Tunel）检测肺脏细胞凋亡细胞凋亡检测试剂盒（包括标记缓冲液、TdT、DIG－dUTP、封闭液、生物素化鼠抗地高辛抗体、SABC、Proteinase K、抗体稀释液）（武汉博士德生物工程有限公司），DAB购自北京中杉金桥生物技术有限公司，其余均为国产分析纯。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞，阴性细胞苏木素复染胞核呈淡蓝色。

1.7 免疫组织化学检测肺脏组织凋亡相关因子和炎症因子 采用免疫组化SP方法（实验步骤参照文献报道及试剂盒说明加以改进）对挤压伤复合低氧缺水缺食后大鼠肺脏组织中凋亡相关因子（Bax），炎症因子（TNF-α）的表达进行检测。阳性结果为棕黄色，位于细胞浆，苏木素复染胞核呈淡蓝色。

1.8 图像分析及定量方法 在光镜10×40倍视野下，应用CMIAS-II图像分析仪对Bax、TNF-α免疫组化进行平均光密度（MOD）测定，每组切片随机选取3个视野。

1.9 统计学处理 采用统计软件SPSS 10.0进行方差分析。数据以±s表示。P＜0.05差异显著，P＜0.01差异非常显著。

2 结果

2.1 死亡情况 正常对照组和单纯挤压伤组大鼠直到第11天未发生死亡；三缺组到了第5天死亡率为0，第7天、第9天和第11天死亡率分别为9.5%，64.3%和100%；复合组死亡率到了第3天为0，第5天和第7天死亡率分别为53.3%和100%，其第5天和第7天时的死亡率显著高于三缺组（P＜0.05）。三缺组平均存活时间（8.2±0.7）天，后者平均存活时间（5.3±0.7）天，复合组平均存活时间显著缩短（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠不同时间死亡情况（%）

2.2 大鼠动脉血气参数的变化

2.2.1 血PaCO2变化 与正常对照组比较，单纯挤压伤组PaCO2总体呈升高趋势，但均无显著差异。三缺组各时间点PaCO2均显著低于正常对照组和单纯挤压伤组（P＜0.05，P＜0.01）；复合组各时间点PaCO2同样均显著低于正常对照组和单纯挤压伤组（P＜0.05，P＜0.01），与三缺组呈类似规律，但第5天显著高于三缺组（P＜0.01）。见图1。

图1 各组大鼠不同时间段动脉血PaCO 2的变化（mmHg）注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与单纯挤压伤组比较，△△P＜0.01；与三缺组比较,##P＜0.01

2.2.2 血PaO2变化 与正常对照组比较，单纯挤压伤组总体呈下降趋势，其中第7天显著降低（P＜0.01）；三缺组和复合组动脉血PaO2均显著低于正常对照组和单纯挤压伤组（P＜0.05，P＜0.01），而两组间无显著差异。基于复合组PaO2和PaCO2均显著降低，提示可能发生代谢性酸中毒。见图2。

图2 各组大鼠不同时间动脉血PO 2的变化（mmHg）注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与单纯挤压伤组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

2.3 大鼠体重、肺重和肺指数的变化

2.3.1 大鼠体重的改变 正常对照组从第1天开始，直到第11天体重呈增加趋势。单纯挤压伤组从第1天、第3天与正常对照组比较基本一致，第5天、第7天、第9天、第11天体重显著低于对照组（P＜0.05），其中第9天后体重虽有增长趋势，但较正常对照组明显延缓。三缺组和复合组于第1天、第3天、第5天、第7天体重呈显著进行性下降（P＜0.01），其中复合组尤为显著，同时，较单纯挤压伤组体重有显著差异。第1天、第3天、第5天单纯挤压伤组对大鼠体重无明显影响，低氧缺水缺食对大鼠体重有明显影响，合并挤压时对大鼠体重具有差异显著。见图3。

2.3.2 大鼠肺重的变化 正常对照组和单纯挤压伤组从第1天开始，直到第11天肺重呈略升高趋势，两组间未见明显差异。三缺组和复合组肺重呈略降低趋势，其中第5天、第7天三缺组与正常对照组比较差异显著（P＜0.05），其余均无显著差异。见图4。

图3 各组大鼠不同时间体重的变化（ g）注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与单纯挤压伤组比较，△△P＜0.01；与三缺组比较，##P＜0.01

图4 各组大鼠不同时间肺重变化（ g）注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与三缺组比较，#P＜0.05

2.3.3 大鼠肺指数的变化 正常对照组和单纯挤压伤组从第1天开始，直到第11天呈略上升趋势，两组间无显著差异，三缺组和复合组从第1天、第3天、第7天、第11天肺指数显著增大，且均较正常对照组和单纯挤压伤组有显著差异（P＜0.01），尤其复合组第5天最为明显。单纯挤压伤组对肺脏指数无显著差异，三缺组及复合组中大鼠由于体重明显下降，导致其肺脏指数增加。见图5。

2.4 大鼠肺脏光镜结构改变

图5 各组大鼠不同时间肺脏指数的变化（‰）注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与单纯挤压伤组比较，△△P＜0.01

2.4.1 基本病变 正常对照组大鼠的肺组织表现为正常肺泡结构。单纯挤压伤组大鼠的肺组织第1天和第3天主要表现为轻度充血，肺泡隔增宽，肺泡腔缩小；第5天、第7天上述病理改变无明显加重。三缺组第1天、第3天、第5天轻度充血，第7天、第9天充血略加重，偶见点灶状出血，轻微水肿，第11天死亡，上述病变进行性加重。复合组肺组织在第1天和第3天有小叶局灶性间质性肺炎样改变，轻微血循环障碍，部分肺泡间隔增宽，在第5天和第7天以充血、血停滞、点灶状出血、轻度水肿等血循环障碍为主，并有数量不等的血栓（红血栓）形成。见图6。

2.4.2 肺病变程度分级 综合分析肺脏病变程度和范围，病变可分为4种程度[3]。轻度，即轻微血循环障碍，病变以肺泡腔缩小，肺泡隔增宽为主，呈点灶状分布；中度，病变仍以肺泡腔缩小，肺泡隔增宽为主，呈多发点灶状分布，此外存在轻度充血，肺炎样改变；重度，重度充血，点灶状出血，累及范围较大；极重度损伤，充血、血停滞、点片状出血、轻度水肿等血循环障碍为主，累及范围广泛，并有数量不等的血栓形成。见表2。

2.5 大鼠肺组织电镜超微结构改变 正常对照组肺组织的肺泡细胞、血管及间质等超微结构清晰，正常。第7天复合组肺组织的超微结构改变，肺组织肺泡Ⅱ型上皮细胞板层小体空化，部分凝聚成团，线粒体肿胀、空泡化、基质极度减少，嵴断裂，甚至部分缺如，内质网扩张，细胞核形态不整，染色质凝聚成团块状、边移，沿核膜分布，细胞凋亡，甚至固缩，还出现特异性的“多层环行小体”结构；肺泡Ⅰ型上皮细胞均见类似病变；各级血管不同程度充血，红细胞和白细胞充盈，并见外溢至间质内；间质纤维细胞、成纤维细胞、淋巴细胞均见不同程度凋亡和变性。见图7。

表2 各组大鼠肺组织损伤光镜病变程度比较（n =6）

图6 各组大鼠不同时间肺组织损伤光镜下病理变化（ 1、 2×100； 3～12×400）

图7 复合组伤后第7天肺组织超微结构改变（ A、D× 15000；B×12000；C×8000； E、F×10000）

2.6 原位末端标记方法检测大鼠肺脏细胞凋亡正常对照组肺组织细胞核中Tunel呈棕黄色阳性表达。第7天，与正常对照组相比，单纯挤压伤组，三缺组和复合组肺脏凋亡细胞依次多于和重于正常对照组，呈加重趋势。见图8。

图8 各组大鼠伤后第 7天肺脏原位末端标记检测细胞凋亡比较注：A正常对照组少量表达；B单纯挤压伤组凋亡细胞增多；C三缺组凋亡细胞明显增多；D复合组凋亡细胞增多更明显。(TUNNEL×400)

2.7 肺组织细胞凋亡相关因子Bax表达的改变正常对照组肺组织细胞胞浆中Bax呈棕黄色阳性表达；与正常对照组相比，除单纯挤压伤组第3天和三缺组第5天外，其余各组于各时间点均基本呈现不同程度的表达增强、MOD值增高趋势，其中单纯挤压伤组于第1天、三缺组于第3天和第7天，复合组于第7天MOD值显著增高（P＜0.05），并于第7天依次较单纯挤压伤组、三缺组加重的趋势。见图9。定量分析结果。见图10。

图9 各组大鼠第7天大鼠肺组织细胞胞核Bax的组化图片。注：A正常对照组Bax呈少量阳性表达；B单纯挤压伤组Bax阳性表达增强；C三缺组Bax阳性表达明显增强；D复合组Bax阳性表达增强更明显。（SP×400）

图10 各组大鼠不同时间肺组织细胞Bax表达的变化注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与单纯挤压伤组比较，△P＜0.05

2.8 肺组织炎症因子TNF-α表达的改变 正常对照组肺组织细胞胞浆中TNF-α呈棕黄色阳性表达；与正常对照组相比，除单纯挤压伤组第1天外，其余各组于各时间点均基本呈现不同程度的表达增强、MOD值增高趋势，其中三缺组于第1天和第3天、复合组于第1天MOD值显著增高（P＜0.05）。见图11。定量分析结果。见图12。

3 讨论

图11 各组大鼠伤后第 7天肺组织细胞胞浆TNF-α的组化MOD值比较。注：A正常对照组,呈阳性表达；B单纯挤压伤组阳性表达增强；C三缺组阳性表达明显增强；D复合组阳性表达增强更明显。（SP×400）

图12 各组大鼠不同时间肺组织细胞TNF-α表达的MOD值比较注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与单纯挤压伤组比较，△P＜0.05

国内外除见2例个案报道外[1-2]，在近10年国内出版的多部有关灾害医学救援和创伤外科学专著中大部分仅关注和阐述远隔器官的肾脏，少数涉及心脏，而对肺脏、肝脏、胃肠和淋巴免疫器官等组织则极少甚至未提及[4-7]。李学博等[1]报告某男因双手被卡在搅拌机中发生严重挤压伤，术中出现躁动、呼吸困难、心跳加快、血压下降，经抢救无效死亡。尸检发现主要病变为双肺严重淤血并广泛肺水肿、被膜下点灶状出血，肺血管内多发脂肪栓塞，左心室前壁点灶状出血。综合分析认为，患者死亡于双手严重挤压伤伴指骨及掌骨的多发性粉碎性骨折、软组织挫碎裂伤造成肺脂肪栓塞。赵军等[2]报道某建筑民工左足被铁轨砸伤且深达骨质，出血严重，机体一般状况尚好，因突发呼吸不规律，意识模糊，抢救无效死亡。尸检同样发现其双肺水肿，尤以肺下叶严重，并见左肺动脉及右心内索条状血栓，其死亡原因也是由肺栓塞引起。曾报道汶川地震中被确诊为挤压综合征的149例中除全部发生急性肾功能衰竭外，并提及合并发生了急性呼吸窘迫综合征、多器官功能衰竭、脓毒症、充血性心力衰竭等多种并发症[8]。迄今未见有关挤压伤并发肺脏病理生理变化及其机制方面的专题报道或实验研究资料。特别是关于深埋条件下发生的挤压伤复合低氧缺食缺水（即复合性挤压伤）人员的肺脏病理生理变化及其在挤压综合征中意义更未涉足，亟待揭示。

基于地震灾害、劣质工程事故、爆炸等可造成房屋建筑垮塌，多见人员被掩埋，且掩埋在深层废墟内的人员受到挤压伤及低氧缺水缺食等影响，多呈现出复合性挤压伤，一种掩埋条件下特有的新伤类，特别是掩埋条件下挤压伤发生率和死亡率均较高（如在2008年汶川大地震中，挤压综合征致死率为极严重创伤导致直接死亡者之后的第2位[9]）的启示。本研究立足模拟灾害性掩埋条件下，探讨肺脏功能、结构的损伤特点及规律（关于其他脏器如肾、心、肝、脑、淋巴免疫器官等另文报道）。本研究结果表明，单纯挤压伤组大鼠全部存活，肺脏的病理损伤以血循环障碍（充血）为主，且于所观察的第11天内均较轻微（属于轻度到中度）；三缺组大鼠从第6.5天至第11天内全部死亡，其肺脏的病理损伤同样以血循环障碍（充血）为主，偶见点灶状出血和轻微水肿，其特点为所观察的第11天内呈逐渐加重，即从第1天至第9天内属于轻度到中度，仅从第9.1天至第11天死亡的2/13例为重度，然其并非属于致死性病变；复合组大鼠全部从第4.2天至第6.8天死亡，其中23/25例从第4.2天至第6.0天死亡，其肺组织在第1天至第3天时发生小叶局灶性间质性肺炎样改变，轻微血循环障碍，而在第4天至第7天时血循环障碍则明显加重，均达到重度，以充血、血停滞、点灶状出血、轻度到中度水肿等血循环障碍为主，并有数量不等的血栓（红血栓，弥散性血管内凝血）形成，同时，肺组织的细胞凋亡渐增多，炎症反应渐加重，其损伤病变具有高发性、进行性、全肺性特点。提示复合组的上述肺脏病变虽未构成机体的直接死亡原因，也未达到急性呼吸窘迫综合征的程度，但参与了由挤压伤复合低氧缺水缺食导致的多器官衰竭的发生发展过程，加速了机体的死亡，表明肺脏是加重复合性挤压伤并发多器官功能障碍衰竭、促进死亡的重要敏感远隔脏器之一。总之，仅就肺脏病变程度而言，肺脏虽并非属于直接导致死亡的“关键”靶器官，然而在灾害现场紧急救援和后续救治中均需予以关注。

Bax是最早发现的促凋亡因子之一，其生物学作用是拮抗抑凋亡因子Bcl-2。研究证实，Bcl-2/Bax两蛋白之间的比例是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素。Bcl-2与Bax形成低水平Bcl-2-Bax二聚体来终止细胞凋亡的发生。此外，Bcl-2蛋白可调节线粒体渗透性转运孔道来改变线粒体膜的通透性，防止线粒体内容物如细胞色素C释放入胞质而激活Caspase-3，进而抑制细胞凋亡。若Bax水平较高则可能形成较高的Bax同源二聚体，促进细胞色素C释放，从而加速细胞凋亡的发生。本研究3种致伤实验组于各时间点的Bax表达均呈增强、MOD值亦增高趋势，尤其复合组更为明显，提示相关因子Bax参与其细胞凋亡的发生发展过程，加重损伤病变。

[1]李学博，莫耀南，陈为刚，等.双手挤压伤后肺脂肪栓塞死亡1例[J].法医学杂志，2008，24（4）：304-305.

[2]赵 军，马志鹏，金春亭，等.左足挤压伤术后并发深静脉栓塞致急性肺栓塞死亡1例[J].河北北方学院学报（医学版），2010，27（6）：65.

[3]王德文.现代军事病理学[M].北京：军事医学科学出版社，2002：84-92.

[4]王正国.实用创伤外科学[M].福州：福建科学技术出版社，2009：253-255.

[5]王正国.野战外科学[M].北京：人民卫生出版社，2010：458-483.

[6]郑静晨，侯世科，樊豪军.灾害救援医学[M].北京：科学出版社，2008：269-271.

[7]孙颖浩，夏 阳.城市恐怖袭击医学救援指南[M].上海：第二军医大学出版社，2010：175-176.

[8]He Q，Wang F，Li G，et al.Crush syndrome and acute kidney injury in the Wenchuan Earthquake.J Trauma，2011，70（5）：1213-1217.

[9]石 波，杨天府，王 军，等.汶川地震中挤压综合征所致急性肾损伤[J].中华急诊医学杂志，2009，18（6）：640-642.

（收稿：2013-01-21修回：2013-01-25编校：齐 彤）

Functional and pathological changes of the lung of continuous crush injury rats with hypoxia and deprivation of food and water under simulant deeply buried condition

LIU Zhi-rui,WANG De-wen,ZUO Hong-yan,WANG Shao-xia,GUO Xiao-ming,WANG Jing-wen,CAO Huan-rong.Institute of Radiation Medicine,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China
Corresponding author,E-mail：wangdewen1938@yahoo.com.cn

Objecttiivee：To study the life tolerance and lung function and pathological changes of rats subjected to continuous crush injury combined with hypoxia and deprivation of water and food under simulant deeply buried condition.Metthodss：One hundred and forty four male Wistar rats were randomly divided into four groups：control group,crush group,hypoxia combined with deprivation of water and food group(three lack group),and crush injury combined with hypoxia and deprivation of water and food group(combined group).The crush injury model was established by clamping the proximal ends of double hind limbs with the pressure set as(4.5±0.3)kg.The arterial blood gas(PaCO2,PaO2)in rats was measured at 1,3,5,7,9 and 11 days after injury,respectively. The lung of the rat was incised,and the histological section was made.The lungs were observed under optical and electronic microscopes.Apoptosis of lung cells was detected by TUNEL staining.The expression of Bax and TNF-α related to apoptosis and inflammation was examined by SP method.Ressullttss：In the combined group,all rats died within 7 days after injury.All rats died within 11 days after injury in the three lack group.No death was observed in the control group and the crush group.PaCO2and PaO2in the combined group and the three lack group decreased rapidly until death.PaCO2mildly increased,while PaO2mildly decreased in the crush group.In the combined group,the lung index was increased,and the pathological changes were mainly disturbance of blood circulation such as hyperemia,blood stagnancy,local hemorrhage,low-grade to middle-grade dropsy.Several thrombus(red thrombus, disseminated intravascular coagulation)and lobular interstitial pneumonia were also observed,and the disturbance of blood circulation obviously aggravated from the fourth day to the seventh day.The pathological changes of the three lack group and the crush group were in order alleviated.Conclussiion：The functional and structural changes of lungs are obvious in rats subjected to crush injury combined with deprivation of food and water,which has the characteristic of high frequency,progression and involvement of thewhole lung.This indicates that the lung is one of the important distant organs which can aggravate MODS and promote death.

王德文，E-mail：wangdewen1938@yahoo.com.cn

R 363.2

A

2095-3496（2013）01-0004-07

国家科技部709项目（No.2006FK130006）

100850北京，军事医学科学院二所（刘志瑞，王德文，左红艳，王少霞，郭晓明，王静雯，曹桓荣）