致病疫霉拮抗菌LH－03的抗菌物质分析及其防病作用

蒋继志，黄杰，吴真真，刘海珍

（河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002）

致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的马铃薯晚疫病是全球马铃薯生产中最具毁灭性的病害，其造成的经济损失、防治难度以及对全社会的影响已超过了水稻稻瘟病和小麦锈病，被视为国际第一大作物病害［1］.生产中除利用有限的抗病品种和适宜于局部地区的农业栽培措施外，化学农药仍是主要的防治措施.但随着病菌A2交配型相继在世界各地出现，病菌生理分化和遗传变异更加迅速且复杂，由此导致的品种抗病性丧失、病菌抗药性、农药残留以及环境污染等一系列问题日益突出，更加大了马铃薯晚疫病的防治难度［2］.利用拮抗真菌［3］、细菌［4］、放线菌［5］及其代谢产物抑制致病疫霉，控制马铃薯晚疫病已成为当前重要的研究方向之一.本课题组在前期已探明梨黑斑病菌（Alternaria alternata）LH－03菌株及其发酵液对致病疫霉均有显著的抑制作用，抑制率分别为58%和70.2%，与白菜黑斑病菌发酵液混合后的抑菌率可达90.38%［6］，优化发酵条件后其发酵液的抑菌率可达85%［7］.本实验旨在明确该菌株产生的抗菌物质的基本性质以及防病效果，为抗菌物质的分离提纯、结构分析鉴定和实际利用提供依据.

1 材料与方法

1.1 供试菌种

梨 黑 斑 病 菌（Alternaria alternata（Fries）Keissler）LH－03 及 致 病 疫 霉（Phytophthora infestans（Mont.）de Bray）Z108，为本实验室保存菌种.

1.2 发酵液的最适抑菌质量浓度确定

依据刘海珍等［7］优化的发酵条件制备LH－03菌株发酵液，经细菌过滤器（0.22μm）除菌后，冻干或用无菌去离子水稀释，配制成质量浓度（ρ）分别为47.7（浓缩10倍），23.85（浓缩5倍），4.77（原液），0.48（稀释10倍），0.10（稀释50倍），0.05mg／mL（稀释100倍）的溶液，以等体积液体培养基作对照，采用滤纸片法测定抑菌活性，统计抑菌率［6］.

1.3 发酵液中抗菌物质的初步分析

LH－03菌株发酵液中抗菌物质的分析主要包括：1）先用乙醇再用硫酸铵沉淀［8］，用2倍体积95%（体积分数）乙醇沉淀，离心后的上清液经50 ℃旋转蒸发除去乙醇后得A 组分，沉淀用无菌去离子水溶解后得B组分，A 组分再经559g／L硫酸铵沉淀，离心后上清液经透析得到C 组分，沉淀为D 组分，以细菌过滤器除菌后用滤纸片法［6］分别测定A，B，C和D 各组分的抑菌活性，以等体积95%（体积分数）乙醇和559g／L 硫酸铵为对照；2）先确定硫酸铵质量浓度再用乙醇沉淀［8］，以194，258，326，398，476，559g／L的硫酸铵分级沉淀，得到最适硫酸铵质量浓度所沉淀的E组分；E组分再经2倍体积95%乙醇（体积分数）沉淀，离心后的上清液经旋转蒸发除去乙醇得F组分，沉淀用无菌去离子水溶解后得G 组分，过滤除菌后分别测定E，F 和G各组分的抑菌活性［6］；3）用蛋白酶K 和酚－氯仿－异戎醇处理对致病疫霉有显著抑制活性的粗蛋白提取物［8］，1 350mL粗蛋白提取物中加入0.2mg／mL蛋白酶K 液150μL，37 ℃下反应5h，或加入等体积的酚－氯仿－异戊醇（三者的体积比为25:24:1）溶液，充分混匀后经4 ℃、10 000r／min离心20min，上清液经细菌过滤器除菌后，以酚－氯仿－异戊醇溶液作对照测定抑菌活性［6］；4）硫酸铵沉淀所得的蛋白质类物质按照文献［8］的方法制备蛋白样品、电泳缓冲液、分离胶和浓缩胶等进行SDS－PAGE电泳.

1.4 粗蛋白的最适抑菌质量浓度及在马铃薯块茎切片上的防病作用

最适质量浓度硫酸铵所沉淀的粗蛋白质量浓度的测定采用考马斯亮蓝G－250比色法［9］，得到的粗蛋白提取物用无菌去离子水定容、细菌过滤器除菌后，再以无菌去离子水分别稀释0 倍（3.50 mg／mL）、2 倍（1.75mg／mL）、5倍（0.70mg／mL）、8倍（0.44mg／mL）、10倍（0.35mg／mL）和20倍（0.18mg／mL），滤纸片法测定其抑菌活性［6］，并按照文献［8］的方法测试粗蛋白溶液在马铃薯块茎切片上对致病疫霉的预防效果.

2 结果与分析

2.1 发酵液的最适抑菌质量浓度

LH－03菌株不同质量浓度的发酵液对致病疫霉菌丝生长均有明显的抑制作用，由图1可看出，随发酵液质量浓度增加，抑菌作用逐渐增强；发酵液稀释100倍（0.05mg／mL）后其抑菌作用最弱，但抑菌率也达到了73%左右，浓缩10倍（47.7mg／mL）后的抑菌作用最强，抑菌率可高达96%左右.

2.2 发酵液中抑菌物质的分析

发酵液原液经乙醇沉淀后得到的A 组分（上清液）与B组分（沉淀）的抑菌率分别为72.5%和33.3%，A组分再经硫酸铵沉淀后得到的C组分（上清液）和D 组分（沉淀）的抑菌率分别为9.3%和66.7%.表明发酵液中的主要抑菌成分不能被乙醇沉淀，但能被硫酸铵沉淀.进一步用硫酸铵分级沉淀的方法沉淀发酵液中的抑菌物质，结果如图2所示，随硫酸铵质量浓度增加，所得物质对致病疫霉的抑制作用增强，其中以559g／L的硫酸铵沉淀下来的E组分对致病疫霉的抑菌作用最强，抑菌率达到了83%，这说明硫酸铵质量浓度越高，能沉淀下来的抑菌物质可能越多，因此抑菌率也就越高；硫酸铵沉淀E 组分后，上清液再经乙醇沉淀后得到的F组分（上清液）和G 组分（沉淀）对致病疫霉均无抑制作用，表明发酵液中对致病疫霉发挥抑制作用的主要抑菌物质可能是蛋白类物质.将经过559g／L硫酸铵沉淀获得的粗蛋白用蛋白酶K 和变性剂酚－氯仿－异戎醇分别处理后，前者对致病疫霉的抑菌率为62.6%，后者无抑菌作用，表明该粗蛋白对蛋白酶K 具有一定的耐受性，但对变性剂（酚－氯仿－异戎醇）敏感；进一步用酚－氯仿－异戎醇处理发酵液原液后，发现发酵液原液也丧失了抑菌活性，由此证明LH－3发酵液中的抗菌物质为蛋白类物质.

图1 不同质量浓度发酵液对致病疫霉菌丝生长的影响Fig.1 Effect of fermentation liquid mass concentrations on mycelial growth of Phytophthora infestans

图2 不同质量浓度硫酸铵溶液中粗蛋白对致病疫霉菌丝生长的影响Fig.2 Effect of sulphate ammonium mass concentrations on growth of Phytophthora infestans

2.3 粗蛋白的电泳分析

LH－03菌株发酵液中经不同质量浓度的硫酸铵沉淀得到的粗蛋白，在质量浓度60g／L 的浓缩胶和120g／L的分离胶条件下，SDS－PAGE电泳的效果较好（图3）.其中194和258g／L 硫酸铵处理下未见蛋白条带出现，可能是沉淀的蛋白含量比较少；而326～559mg／L的硫酸铵处理下均清晰地显示出1条带，其分子质量大小约为40ku.

2.4 粗蛋白的最适抑菌质量浓度

考马斯亮蓝G－250比色法测得100mL 发酵液中经559g／L 硫酸铵沉淀所得粗蛋白的质量浓度约为17.5mg／mL，用不同质量浓度的粗蛋白抑制致病疫霉后，发现随粗蛋白质量浓度降低，抑制作用逐渐减弱，粗蛋白质量浓度为3.5mg／mL时的抑制率最高（68%），但稀释20倍后其抑菌活性几乎完全丧失（图4）.以质量浓度为3.5mg／mL的粗蛋白溶液处理马铃薯块茎切片后（图5），发现粗蛋白溶液对块茎切片无不良影响（图5a），对致病疫霉侵染块茎切片有良好的保护作用（图5b），保护率达95%以上.

图3 粗蛋白的SDS－PAGE电泳分析Fig.3 SDS－PAGE analysis of crude proteins

图4 不同浓度粗蛋白对致病疫霉菌丝生长的抑制作用Fig.4 Inhibition of crude proteins at different concentrations on Phytophthora infestans

3 讨论

利用拮抗微生物及其代谢产物抑制致病疫霉进而控制马铃薯晚疫病已展示出较大的应用潜力［1］，筛选获得的一些拮抗真菌，在平板上能完全抑制致病疫霉菌丝的生长，抑菌率达到100%，在离体组织、盆栽植株和温室中的防病效果能分别达到95%，90%和80%［10］，但迄今作为生防制剂实际用于田间防治马铃薯晚疫病的拮抗真菌还不多见，主要是这些菌株或其代谢产物在大田中的防病效果常常急剧下降甚至完全丧失，致使这些菌株无法利用，笔者认为主要原因是对拮抗菌株所产生的抗菌物质的研究还十分有限.Son等［11］研究发现植物内生尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）EF119菌株主要是通过比卡菌素（bikaverin）和镰刀菌酸（fusaric acid）抑制致病疫霉，对番茄晚疫病的防效分别为71%和67%，且明显抑制其他植物病原卵菌、真菌和细菌的生长；苏珍珠等［10］的研究表明，几株内生镰刀菌是依靠毒素抑制致病疫霉，其中有3株菌（e012－3，e060－4和e032）毒素粗提液的抑菌率均达到100%，对马铃薯叶片的保护率达到97.1%；Eschen－Lippold等［12］的研究结果显示，象牙白蜡伞（Hygrophorus eburneus）是以γ－Oxocrotonate脂肪酸抑制致病疫霉等多种病菌孢子萌发和菌丝生长，提前喷雾可有效防治马铃薯晚疫病；刘晓芸等［13］探讨了黑附球菌（Epicoccum nigrum）拮抗致病疫霉的活性物质，发现该菌株产生的蛋白和多糖无明显抑菌作用，但粗脂肪有一定的抑制作用，对孢子囊萌发的抑制中质量浓度为1 301.1μg／mL，同时发现去除多糖后的胞外物质有较强的抑制作用，对孢子囊和菌丝生长的抑制中质量浓度（EC50）分别为576.3μg／mL 和850.1μg／mL；本实验中拮抗真菌LH－03菌株产生的抗菌物质为蛋白质类物质，其分子质量大小约为40ku，与上述对致病疫霉拮抗真菌产生的活性物质的报道均不相同，说明致病疫霉拮抗真菌产生的抗菌物质多种多样.尤其是本研究中的LH－03菌株产生的粗蛋白对致病疫霉菌丝生长的抑菌率虽然不是很高（72%），但在马铃薯块茎切片上对致病疫霉侵染的保护率可达95%以上，表明该抗菌物质具有双重作用，不仅明显抑制致病疫霉生长，还有可能诱导马铃薯块茎对晚疫病的抗性.因此，利用该粗蛋白防治马铃薯晚疫病有很大潜力，对该蛋白质的分离纯化有待尽快开展，以加快对该蛋白质防病效果、作用机理、实际利用等方面的进程.

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