谷氨酰胺转胺酶对猪血浆蛋白凝胶特性的影响

王芳，贾万利，李会珍

（中北大学化工与环境学院，山西 太原 030051）

转谷酰胺酶（Transglutaminase，TG）存在于动物、植物和微生物中，不同来源的酶都各有自己的性质，目前研究和应用最多的酶是来源于微生物轮枝链霉菌（Streptoverticillum mobaraense）的酶，这是目前唯一商业化的转谷酰胺酶。微生物转谷酰胺酶（MTG）是一种不依赖钙的酶，此外，它对氨基酸残基的专一性要求也比较低。因此与其他来源的转谷酰胺酶相比，MTG 酶能与更多蛋白质的氨基酸残基发生反应，而且MTG 酶形成的质构特性更优。MTG 酶能够催化蛋白质中谷氨酰胺残基与赖氨酸之间的酰基转移反应，通过胺的导入、交联形成共价键，从而形成蛋白质网络结构，可在一定程度上改善蛋白质的结构和特性。近年来，有研究报道外源性谷氨酰胺转氨酶能催化食品蛋白质交联或谷氨酰胺转氨酶介导蛋白质的聚合作用，从而改善相应蛋白质功能特性。研究的蛋白质种类包括牛奶酪蛋白、大豆蛋白、蛋清蛋白、猪肉肉糜、牛肉肉糜等，研究内容包括酶对食品基质的作用效果，以及酶对蛋白质底物的催化特性及机理[1-6]。

猪肉是我国居民消费量最多的一类肉，猪血产量可达到10.5 亿kg[7]。猪血中含有至少100 种不同的蛋白质组分，其中血浆白蛋白占60%，血浆球蛋白占35%，血纤维蛋白占4%，很多都可以作为食品的功能性组分[8-9]。目前国内外对猪血的综合利用，主要有制作饲用血粉、提取生化药品，如血红素、超氧化物歧化酶、蛋白胨等，此外还有很大一部分用于提取血浆蛋白并应用在食品中。工业化屠宰得到的血浆可用于肉品加工，如猪血浆还可以作为脂肪替代品应用在低脂肉制品中[10]。猪血在香肠中的应用则更为普遍[11]，其中血浆的作用是在热诱导条件下形成凝胶，增强香肠的质构特性[12]。

猪血形成热凝胶的能力和其乳化特性对食品加工是非常重要的[13]。能形成热诱导凝胶的主要是血浆白蛋白，钙以及凝血相关的酶能增强凝胶活性。有研究报道了猪血浆蛋白热诱导凝胶质构特性及持水性因素的研究，认为血浆蛋白浓度、加热时间、离子种类和pH 都对凝胶特性有影响[14]。对猪血浆蛋白凝胶性质的系统研究有利于其在食品中的应用[15]。本试验主要探讨微生物谷氨酰胺转氨酶的添加及作用条件对猪血浆蛋白凝胶质构特性及持水性的影响，以期找到MTG 酶对猪血凝胶的作用规律，找到最佳的酶处理方式。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

微生物谷氨酰胺转胺酶（MTG 酶）：酶活性为100 U/g，日本味之素株式会社；柠檬酸三钠（分析纯）。

1.2 仪器与设备

TA-XPLUS 质构仪：英国Stable Micro System 公司；SD-1000 Spray Dryer：日本东京理化株式会社；ALC-210 型万分之一电子天平：Acculab 公司；TDL-5C低速台式大容量离心机：上海安亭科学仪器厂；S20P SevenEasyTMPlus pH 酸度计。

1.3 方法

1.3.1 猪血浆蛋白粉的制备

收集新鲜猪血，添加8 g/100 mL 柠檬酸三钠以防止凝血，在4 ℃以1 388 g 离心10 min，得到猪血浆蛋白。猪血浆蛋白以进风温度240 ℃，出风温度85 ℃进行喷雾干燥制得猪血浆蛋白粉。其水分含量为7.5%（质量分数），蛋白质含量为82%（质量分数）。

1.3.2 添加MTG 酶的猪血浆蛋白凝胶制备

表1 谷氨酰胺转氨酶在猪血浆蛋白凝胶中的添加方式Table 1 Levels of transglutaminase addition in porcine blood plasma gel

1.3.3 猪血浆蛋白凝胶失水率测定

失水率测定前样品提前从4 ℃冰箱中取出，于室温放置30 min。凝胶柱（长14 mm，直径8 mm）置于离心管（0.45 μm）中，以4 000 g 离心10 min，测定样品损失的重量，每个样品重复3 次，取平均值。失水率计算公式如下：

式中：M1为离心前凝胶柱质量；M2为离心后凝胶柱质量。

1.3.4 质构测定

质构测定前样品提前从4 ℃冰箱中取出，于室温放置30 min。样品为直径8 mm，长14 mm 的圆柱，应用TPA 程序测定硬度、弹性和内聚性。样品用铝圆柱探头（直径50 mm）下压两次，高度为初始高度的25%，前速度为60 mm/min，下压至30 %变形，下压速度为1 mm/s，回复时间为2 s，硬度、弹性、内聚性值由TPA曲线计算。每个样品重复3 次取平均结果。数据结果采用最短显著极差法（SSR 法）进行多重比较[16]。

2 结果与讨论

2.1 MTG 酶添加量对猪血浆蛋白凝胶失水率的影响

MTG 酶添加量对猪血浆蛋白凝胶失水率的影响见图1。从图1 可以看出，与未添加MTG 酶的猪血浆蛋白凝胶失水率相比，MTG 酶处理组凝胶的失水率显著降低（P＜0.05），说明MTG 酶的添加显著提高了猪血蛋白凝胶的持水性。但是从酶浓度和保温时间组合的6 个试验组的结果来看，酶浓度和保温时间对凝胶失水率的影响是相互依赖的，不存在单向促进或减少的作用趋势。在保温时间为30 min 的4 组处理中，随着酶添加量增大，凝胶失水率减小，表明酶量的增加提高了凝胶的持水性。而在保温60 min 的4 组处理中，酶量在0.6 g/100 mL 时凝胶的持水量达到最高，酶量的继续增加对持水性没有进一步的增强作用，反而有所降低。

图1 MTG 酶添加量对猪血蛋白凝胶失水率的影响Fig.1 Effect of MTGase on water released of porcine plasma protein gels

如果MTG 酶添加量固定，在0～0.6 g/100 mL 的范围内，40 ℃保温时间越长，则凝胶失水率越小。血浆蛋白是赖氨酸的极好来源，酶处理可以使蛋白质分子间交联，以及小肽分子间的交联，形成坚试的空间结构，将水分子包容其中，从而减小猪血凝胶的失水率。然而，交联率同时取决于赖氨酸和谷氨酸残基的接触概率。猪血浆蛋白中的蛋白质天然状态多为球蛋白，由于其天然状态下紧密的结构，MTG 酶不容易接近目标残基，因而不容易催化发生交联。因此在酶处理过程中保温适当的时间非常重要，因为MTG 酶在催化蛋白质时，存在一个诱导蛋白质结构发生变化的过程，此时，较紧密的蛋白质球状空间结构逐步展开，暴露出内部的疏水性氨基酸残基，二级结构也发生改变[2]。蛋白质受酶的诱导及加热变性部分展开结构后，则可以暴露更多的作用位点，增加酶的敏感性，更易于发生聚合反应。然而，保温时间对于酶敏感性的影响并不是越长越好，增加酶添加量可以缩短保温时间，反之亦然。在试验条件下，酶添加量为0.6 g/100 mL 时40 ℃保温60 min 猪血凝胶持水率最大，添加量0.9 g/100 mL时40 ℃保温30 min 也可以达到相似的效果。以上结果说明保温时间和酶添加量对持水性有协同作用，在试践中可以根据试际需要调整酶用量和作用时间。总的来讲，MTG 酶的添加，增强了猪血浆蛋白凝胶中蛋白质—水分的相互作用力，从而减少了失水率。这一特征在肉品加工中可以增加产品得率，对肉品加工企业有试际意义。

2.2 MTG 酶添加量对猪血浆蛋白凝胶硬度的影响

MTG 酶添加量对猪血浆蛋白凝胶硬度的影响见图2。

图2 MTG 酶添加量对猪血蛋白凝胶硬度的影响Fig.2 Effect of MTGase on hardness of porcine plasma protein gels

图2 表明，添加谷氨酰胺转氨酶后，血浆蛋白凝胶的硬度增大。统计分析表明，酶处理的猪血凝胶样品总体上比对照组硬度显著增加（P＜0.05）。酶添加量在0.6 g/100 mL 并且40 ℃保温60 min 时凝胶硬度达到最大。这可能是谷氨酰胺转氨酶的作用促进了蛋白分子之间的作用力，增加了凝胶硬度，然而添加酶的不同处理组之间硬度差异不显著。值得注意的是，不添加MTG 酶单纯加热也可以提高猪血蛋白凝胶的硬度，血浆组分非常复杂，含有多种酶，热处理可能涉及到蛋白质变性、聚集和凝胶的综合反应，从而使凝胶硬度增加。此外，保温时间也显著影响凝胶硬度（P＜0.05），当保温时间为60 min 时，猪血蛋白凝胶硬度普遍高于保温30 min 组的硬度值。在本试验中尽管没有考虑更高的保温时间，试验室进行的预试验包括保温时间到120 min 表明，在同一个酶浓度水平，保温60 min 就能达到最大硬度值，超过60 min 硬度没有继续增加。如果保温时间一定，则在0～0.6 g/100 mL 的范围内，随着酶浓度的增加，凝胶硬度增加。超过0.6 g/100 mL，酶浓度的增加硬度反而有所下降。这说明MTG 酶添加量与保温时间存在最佳组合，超过酶的最佳处理条件范围，凝胶质构产生副作用。其原因可能是过量的交联共价键将会抑制蛋白质网络均一性的发展。

0.6g/100 mL 的酶浓度相当于4 U/g 猪血蛋白，与文献中报道的值比较一致。文献报道在牛肉凝胶中用到的MTG 酶浓度是1.4 U/g 牛肉蛋白[17]，3 U/g～6 U/g猪肉蛋白凝胶[18]，10 U/g 燕麦球蛋白[19]。用于交联牛乳蛋白的量是20 U/g 牛乳蛋白[20]。

2.3 谷氨酰胺转氨酶添加量对猪血凝胶弹性和内聚性的影响

谷氨酰胺转氨酶添加量对猪血浆蛋白凝胶弹性和内聚性的影响见表2。

表2 谷氨酰胺转氨酶添加量对猪血浆蛋白凝胶弹性和内聚性的影响Table 2 Effect of transglutaminase on springiness and cohesiveness of porcine blood plasma gelling

从表2 可以看出，添加MTG 酶能增加猪血凝胶的弹性，与不添加酶的对照组相比差异显著（P＜0.05），而酶的添加对猪血凝胶的内聚性没有显著影响。在质量浓度0.3 g/100 mL～0.9 g/100 mL 的范围内，不同的酶浓度对猪血凝胶弹性的影响差异不大。与对照组相比，不添加MTG 酶只进行40 ℃保温的处理对猪血凝胶的弹性也有显著影响（P＜0.05），说明加热可以提高凝胶的弹性，但是40 ℃保温60 min 的时间段内，不同的保温时间对凝胶弹性没有差异。

MTG 酶对猪血浆蛋白凝胶质构特性的影响效果有其微观结构解释，食品蛋白质的质构特征比如硬度、内聚力、弹性都可能通过改变自然交联或者在蛋白结构中引入新的交联来试现，因此MTG 酶的添加能够起到蛋白质交联的作用，从而改善凝胶质构.从目前结果来看，添加MTG 酶和加热两个条件都对凝胶的弹性产生影响，但对内聚性不产生显著影响。对于凝胶内聚性的要求需要提供另外的条件进行研究。

3 结论

可以得出结论，血浆蛋白的凝胶特性可以通过添加MTG 酶并保温来改善，尤其是能够减少凝胶失水率。最佳处理条件是添加0.6 g/100 mL 浓度的MTG 酶与猪血浆蛋白溶液在pH 7 时40 ℃保温60 min。在这一条件下，酶处理使凝胶硬度显著增加，并降低凝胶的失水率约3%。值得注意的是，单独热处理也能增加凝胶硬度，而MTG 酶的添加和热处理有协同作用。此外，MTG 酶的添加能显著提高凝胶弹性，但是对凝胶内聚性没有显著影响。总的来说，以上结果表明猪血蛋白凝胶中添加MTG 酶并保温一段时间能促进血浆凝胶特性。应该还有许多其他方法来促进血浆凝胶的特性，如可以结合MTG 酶和还原试剂一起发挥作用，或者通过血浆超滤作用增加亚基浓度，然后再进行酶处理，有待于进一步研究。

[1]唐传核,杨晓泉,陈中,等.微生物转生物转谷氨酰胺酶(MTGase)的蛋白质底物催化特性及其催化机理研究(Ⅰ)MTGase 催化单底物蛋白质的聚合特性[J].食品科学,2003,24(5)：19-24

[2]唐传核,杨晓泉,彭志英,等.微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)的蛋白质底物催化特性及其催化机理研究(Ⅱ)MTGase 催化球状蛋白质的聚合机理[J].食品科学,2003,24(6)：23-27

[3]唐传核,杨晓泉,陈中,等.微生物转谷氨酰胺酶的蛋白质底物催化特性及其催化机理研究(Ⅲ)MTGase 催化多底物蛋白的聚合机理[J].食品科学,2003,24(7)：26-31

[4]姜燕,温其标,唐传核.微生物谷氨酰胺转移酶对大豆分离蛋白凝胶性能的影响[J].食品工业科技,2006,27(5)：59-62

[5]吕心泉,安辛欣,苏燕泉.谷氨酰胺转氨酶在肉制品中的应用研究[J].食品工业科技,2002,23(4)：86-88

[6]梁海燕,马俪珍.谷氨酰胺转氨酶在肉制品加工中的应用[J].食品科技,2004(5)：38-40

[7]江海.猪血-液态肉[J].养生月刊,2004,(2)：118-119

[8]Cofrades S,Guerra M A,Carballo J,et al.Plasma protein and soy fiber content effect on bologna sausage properties as influenced by fat level[J].Journal of food science,2000,65(2)：281-287

[9]Faraji H,Decker E A.Inhibition of phosphatidylcholine liposome oxidantion by porcine plasma[J].Journal of food science,1991,56(4)：1038-1041

[10]Cofrades S,Guerra M A,Carballo J,et al.Plasma protein and soy fiber content effect on Bologna sausage properties as influenced by fat lever[J].Journal of food science,2000,65(2)：281-287

[11]Caldironi H A,Ockerman H W.Incorporation of blood protein extracts in sausages[J].Journal of food science,1982,47(2)：405-408

[12]Ni C,Hayakawa S.Viscoelastic properties of porcine serummyosin gel and the sausage fortified by porcine serum[J].Food science and technology research,2001,7(3)：235-238

[13]Pares D,Ledward D A.Emulsifying and gelling properties of as influenced by high-pressure processing[J].Food chemistry,2001,74(2)：139-145

[14]孔保华,张立娟,刁新平.影响猪血浆蛋白热诱导凝胶质构特性及持水性因素的研究[J].食品科学,2010,31(7)：75-80

[15]Benitez B,Barboza Y,Relkin P,et al.Effect of pH and proteins concentration on gelation property of animal blood[J].Revista cientifica-facultad de ciencias veterinarias,1999,9：190-195.

[16]王钦德,杨坚.食品试验设计与统计分析[M].北京：中国农业大学出版社,2010：79-84

[17]Pietrasik Z,Li-Chan E C Y.Binding and textural properties of beef gels as affected by protein,kappa-carrageenan and microbial transglutaminase addition[J].Food research international,2002,35(1)：91-98

[18]Pietrasik Z,Li-Chan E C Y.Response surface methodology study on the effects of salt,microbial transglutaminase and heating temperature on pork batter gel properties [J].Food research international,2002,35(4)：387-396

[19]Siu N C,Ma C Y,Mock W Y,et al.Functional properties of oat globulin modified by a calcium-independent microbial transglutaminase [J].Journal of agricultural and food chemistry,2002,50(9)：2666-2672

[20]Faergemand M,Murray B S.Interfacial dilatational properties of milk proteins cross-linked by transglutaminase [J].Journal of agricultural and food chemistry,1998,46(3)：884-890