浒苔多糖的酶法提取、纯化及初步结构鉴定

吕海涛，肖宝石，高玉杰

（青岛农业大学化学与药学院，山东 青岛 266109）

浒苔具有多种营养成分，是一种高蛋白、低脂肪，且富含维生素和矿物质的优质海洋食品[1-2]，是食药两用藻类。浒苔在我国野生藻类中资源丰富，其自然繁殖能力特别强，浒苔大面积的爆发会对沿海交通和海洋生态环境造成严重影响。浒苔多糖是浒苔的主要活性物质之一，主要具有抗肿瘤、降低血脂、胆固醇、提高机体免疫力、抗菌、抗病毒、消炎等功效[3-5]。

目前，对于浒苔多糖的提取、纯化和结构鉴定方面已有一些报道[6-8]，但多不系统。本文利用蛋白酶将糖蛋白的化学键打断，提高多糖粗产品的得率和蛋白质的脱除率，并能最大限度的保持多糖的生理活性，经过分离纯化得到其主要活性成分，并进行初步的结构分析，为更好的开发浒苔资源、进一步深入研究浒苔多糖的生理活性及作用机理奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

浒苔：采于青岛汇泉湾。

DEAE-52：Whatman 公 司；Sephadex G-100：GE Healthcare 公司；木瓜蛋白酶（65 万μ/g）：厦门星隆达化学试剂有限公司；牛血清蛋白、葡萄糖（Glc）、甘露糖（Man）、鼠李糖（Rha）、木糖（Xy）：Sigma 公司；考马斯亮蓝G-250：上海试剂三厂；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）、氯化钠、氢氧化钠、苯酚、浓硫酸（分析纯）：天津巴斯夫化工有限公司；醋酸铵、浓硫酸、盐酸（分析纯）：莱阳市康德化学有限公司；无水乙醇（分析纯）：青岛化学试剂厂；乙腈（色谱纯）：天津市津东天正精细化学试剂厂。

90-2 医用低速离心机：江苏省金坛市恒丰仪器厂；Delta320 pH 计：梅特勒-托利多仪器有限公司；AR2140 电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司；SP-754 紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；HH-S 恒温水浴锅：金坛市金城国际实验仪器厂；RE－52AA 旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；LC 10A Tvp液相色谱仪：岛津公司；Eclipse XDB-C18 色谱柱（5 μm 4.6×150 mm）：安捷伦科技公司；N2000 工作站：浙江大学；Cascada 超纯水系统（Pall Corporation），真空冷冻干燥机：德国Martin Christ 公司。

1.2 方法

1.2.1 浒苔粗多糖的提取

取一定量的浒苔粉，加入10 倍量的95%乙醇，回流2 h，除去脂类、单糖及其它醇溶性成分（生物碱、黄酮苷、多酚、氨基酸等），抽滤后，用无水乙醇、丙酮洗涤，干燥。

取脱脂后浒苔干粉5 g，料液比1∶50（g/mL），温度80 ℃，水提4 h 后冷却至室温；再加入400 mg 木瓜蛋白酶，调pH 5.5，60 ℃酶解3 h，95 ℃灭酶15 min。过滤，滤液浓缩至体积的1/3，加入4 倍体积无水乙醇，放入冰箱，过夜。抽滤，将沉淀60 ℃下烘干，得浒苔粗多糖。采用苯酚-硫酸法[9]测定总糖含量，采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[10]。浒苔多糖的平均得率是27.75%，纯度为50.03%，蛋白含量为0.78%。

1.2.2 浒苔粗多糖的分离纯化

称取0.5 g 浒苔粗多糖用少量双蒸水溶解，离心，取上清液在DEAE-52 纤维素柱分离，分别用2 倍柱体积双蒸水、0.1 mol/L NaCl、0.3 mol/L NaCl、0.5 mol/L NaCl 淋洗，每3 mL 收集一管，流速为0.6 mL/min，收集洗脱液。每管取少量进行苯酚-硫酸法显色，在490 nm测其OD 值，以试管数目为横坐标，吸光度为纵坐标做洗脱曲线。分别将最大峰处的洗脱液合并，减压浓缩，流水透析3 d，透析袋内的多糖溶液真空冷冻干燥，得多糖EP1、EP2、EP3和EP4。

1.2.3 EP1 纯度检验

取200 mg EP1，用少量蒸馏水溶解，装入Sephadex G-100 柱分离，用蒸馏水洗脱，每3 毫升收集一管，流速为0.4 mL/min。洗脱液用苯酚-硫酸法显色，490 nm测其OD 值，绘制洗脱曲线。

1.2.4 EP1 紫外光谱和红外光谱分析

配制一定浓度的EP1多糖溶液，在180 nm～640 nm波长间进行扫描。

称取干燥的2 mg EP1，与200 mg 干燥的KBr 粉末在玛瑙研钵中细细研磨均匀，经压片机压片，在4 000 cm-1～400 cm-1波数范围内扫描。

1.2.5 浒苔多糖EP1 单糖分析

称取20 mg EP1 于10 mL 具塞试管内，加入2 mL 2 mol/L H2SO4，100 ℃水解8 h。用4 mol/L NaOH 水溶液中和至pH7.0，并用水稀释到5 mL，离心，取上清液备用。

精密吸取浒苔多糖水解液100 μL 置于离心管中，分别加入100 μL 0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）甲醇溶液和0.3 mol/L NaOH 溶液，混匀后于70 ℃水浴中反应30 min，取出后在4 ℃下冷却10 min，用100 μL 0.3 mol/L HCl 溶液中和，用1 mL 氯仿萃取，充分震荡摇匀，4 500 r/min 离心10 min，弃去有机层，水层萃取3 次，待用。

利用高效液相色谱对衍生后的多糖样品进行分离测定，流动相：1.0 mol/L 醋酸铵缓冲液（pH 6.7）-乙腈（86∶14，体积分数）；流速：1 mL/min；检测波长：245 nm。

2 结果与讨论

2.1 DEAE-52 层析柱对浒苔粗多糖分级

浒苔粗多糖经过DEAE-52 柱层析后，将同一洗脱峰收集合并，透析，冷冻干燥，分别得到四种多糖EP1、EP2、EP3、EP4，见图1。

图1 浒苔多糖EP1的DEAE-52 柱洗脱曲线Fig.1 Elution curve of Enteromorpha polysaccharide on DEAE-52 column

其中EP1的洗脱液为蒸馏水，EP2的洗脱液为0.1 mol/L NaCl，EP3的洗脱液为0.3 mol/L NaCl，EP4的洗脱液为0.5 mol/L NaCl。所得浒苔多糖EP1为白色絮状物，无臭无味，溶于水，不溶于高浓度的乙醇、乙醚、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂。硫酸蒽酮法、苯酚硫酸法显色反应均为阴性，EP1的产率为73.22%。

2.2 Sephadex G-100 层析柱对EP1的分离纯化

浒苔多糖经过层析柱分离后，EP1的得率明显高于其他组分，本文确定EP1为研究对象。图2 为Sephadex G-100 层析柱对EP1 的纯化曲线。

图2 浒苔多糖EP1的Sephadex G-100 洗脱曲线Fig.2 Polysaccharide EP1Sephadex G-100 chromatography curve

由图2 可见只有一个洗脱峰，且峰型对称，因此EP1为同一组分。收集洗脱峰，透析，冷冻干燥，得到EP1纯品，测得回收率为95.35%，纯度为99.69%。

2.3 EP1紫外光谱

EP1组分在180 nm～640 nm 波长间扫描，结果显示在260 nm 和280 nm 处没有吸收峰，说明此多糖不含核酸和蛋白质。

2.4 EP1的红外光谱

EP1的红外光谱，见图3。

图3 EP1的红外光谱图Fig.3 IR spectra of EP1

图3 为EP1 的红外光谱图，3 445.89 cm-1处有强且宽的-OH 吸收峰，是多糖上羟基伸缩振动吸收峰；2 917.77 cm-1附近的峰为饱和C-H 伸缩振动（为-CHCH2 的吸收峰）信号；1 635.94 cm-1附近为糖醛酸残基中羧基的C=O 伸缩振动吸收峰；1 421.28 cm-1代表了C-O 的伸缩振动或者C-H 及O-H 的弯曲振动；1 258.53 cm-1的强峰为硫酸基的S=O 对称伸缩振动吸收峰；1 046.85 cm-1的强宽吸收峰为糖苷键或环内C-O 伸缩振动吸收峰，766 cm-1处出的峰为吡喃糖环的伸缩振动。红外光谱表明EP1 具有多糖的特征吸收峰及硫酸基存在。

3.5 浒苔多糖单糖分析

浒苔多糖单糖分析，见图4。

图4 4 种单糖标准品（a）和浒苔多糖EP1（b）的HPLC 色谱图Fig.4 HPLC chromatograms of four monosaccharide standards（a）and EP1（b）

图4 为标准糖样中单糖的液相色谱图与浒苔多糖的液相色谱图。二个图谱对照，可以确定浒苔多糖EP1主要是由葡萄糖构成，还含有一定量的鼠李糖以及少量的木糖和甘露糖，经外标法计算得知甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、木糖的比例是0.09∶1.0∶3.1∶0.29。

4 结论

以青岛海域浒苔为原料，对浒苔多糖的酶法提取、分离纯化和结构分析进行了系统研究。利用热水-木瓜蛋白酶法从浒苔中提取多糖，采用DEAE-52 纤维素柱分离得到4 种系列多糖EP1、EP2、EP3和EP4。其中EP1是均一的主要成分，具有多糖的特征吸收峰及硫酸基，不含有核酸和蛋白质，其单糖组成为：甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖∶木糖=0.09∶1.0∶3.1∶0.29。本文为浒苔多糖的进一步结构改造，如硒化多糖、稀土化多糖及其抗病毒、抗肿瘤生物活性实验等提供一定的基础。

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