中药I号方对阿尔兹海默病的多靶位治疗作用

梁 良，刘 羽，曹子青，杨亚军，朱 华，黄 澜，盛树力，秦 川，邓 巍

(1.北京协和医学院 中国医学科学院医学实验动物研究所病理室，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021;2.山西省曲沃县西街本草中药研究所，山西 曲沃 043400)

阿尔兹海默病由 Alois Alzheimer在1906年首先报道［1］，它是老年人中最常见的痴呆类型，是一种与年龄相关的神经退行性疾病，是发达国家引起老年人死亡的重要原因之一［2］，其病理表现有细胞外老年斑沉积，细胞内神经纤维缠结、突触丢失、神经元炎症和神经元凋亡［3］。临床表现主要为认知下降和记忆损伤［4］。关于阿尔兹海默病的发病机制虽有很多假说，如淀粉样蛋白级联假说、Tau蛋白假说和胆碱能假说等，但发病机制仍不是很清楚。

目前还没有能够减慢或者停止阿尔兹海默病进展的药物，美国FDA批准的5种药物只能暂时缓解症状而且在病人中效果也不一致［5］。现在对阿尔兹海默病的治疗研究有抗淀粉样蛋白和神经元保护方法［6］。

本实验室以前的研究发现，中药I号方(PN-1)显著提高给药模型鼠的空间记忆力;能够减少给药模型鼠脑内老年斑沉积并能够降低脑内Aβ水平，提高突触可塑性相关分子的表达水平［7］。中药复方成分复杂，很有可能有若干个活性成分，通过多靶位起治疗作用，而现在临床上应用的药物只有一个作用靶点，多靶位治疗有可能比单靶位疗效更好。本实验利用KinexTMAntibody Microarray这种高通量抗体芯片技术，筛选出给药组与空白组模型鼠的差异表达蛋白，然后利用 Ingenuity Pathway Analysis(IPA)这种生物信息学方法并结合文献，从中找到与阿尔兹海默病相关的蛋白，揭示中药的多靶位治疗作用，为阿尔兹海默病的治疗提供新的有效药物。

1 材料与方法

1.1 中药

中药I号方由35味中药组成，其粉剂用蒸馏水煮沸30 min，3次，将上清液合并调整至生药浓度为1 g/mL，用时稀释至0.1 g/mL。本实验中的给药浓度均折合生药质量进行计算。

1.2 实验动物

实验中所用到的阿尔兹海默病小鼠模型为APP/PS1双转基因模型，是我所自己构建的，模型以C57BL/6J小鼠为背景，为含有人APP瑞典突变和人PS1敲除了第九个外显子而造成突变的双转基因小鼠。实验在中国医学科学院医学实验动物研究所病理室进行【SYSK(京)2011-0022】。

1.3 分组及给药

SPF级3月龄的APP/PS1双转基因小鼠，分为给药模型组和空白对照组，其中给药模型组为8只，雄性，每天灌胃给予2.4 g/kg中药水提物，相当于临床用药的36倍;空白对照组4只，雄性，给予等体积双蒸水灌胃。给药时间持续3个月。

1.4 脑蛋白提取及KinexTMAntibody Microarray分析

给药结束后每组随机取出三只分离出海马后按下面过程提取蛋白:

1)每250 mg湿重的切碎的组织使用1 mL蛋白裂解液(北京博肽健诺威生物技术有限公司提供);

2)用冰冷PBS冲洗组织3次以去除血污染物;

3)匀浆机冰上捣碎组织，每次15 s，捣碎3次;

4)用超声波探针粉碎核 DNA，粉碎次，每次10 s，每两次之间隔 10～15 s，在此过程中，样品须始终保留于冰上;

5)用台式离心机上的最高速度 (14，000 r/min)，4℃离心样品，30 min;

6)将上清液部分转移到1.5 mL离心管;

8)使用BCA法测定样品蛋白浓度，分装至少100 μg 用于分析;

然后利用 KinexTMAntibody Microarray(北京博肽健诺威生物技术有限公司提供)分析差异表达蛋白，这种高通量抗体芯片技术能够方便有效的帮助研究者发现有意义的结果，能够分析蛋白表达、蛋白间的相互作用和蛋白的磷酸化。

1.5 利用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)分析与阿尔兹海默病相关的蛋白分子

表1 阿尔兹海默病相关蛋白Tab.1 Proteins associated with Alzheimer’s disease

IPA是一种基于网页的分析软件。它能帮助研究者从多水平了解生物体，分析来自各种平台的数据，使研究者深入理解分子和化学物质间的相互关系、细胞表型和疾病过程。将来自 KinexTMAntibody Microarray分析的数据结果提交给IPA，并结合查阅文献，分析与阿尔兹海默病相关的分子。

2 结果

将KinexTMAntibody Microarray分析后的结果，用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)并结合文献分析后，得到与阿尔兹海默病相关的蛋白见表1。

3 讨论

阿尔兹海默病是老年人中最常见的痴呆类型，到目前为止仍然没有有效的治疗方法，最终导致病人的死亡。在美国，阿尔兹海默病是引起死亡的第六大原因，在65岁以上老年人的死亡原因中居于第五位。随着人口的老龄化，美国的统计数据表明，到2050年，65岁以上的人口中患有阿尔兹海默病的人将达到11000000～16000000。给家庭和个人带来了巨大的经济和精神压力。

到目前为止对阿尔兹海默病的治疗美国FDA共批准了5种药物，其中胆碱酯酶抑制剂类有四种tacrine，donepezil， rivastigmine 和 galantamine;NMDA受体拮抗剂有 Memantine［8］。但是这5种药物均不能延缓或者是停止疾病的进展，而且在病人中的效果也不一致［5］。除了以上5种 FDA批准的药物之外还有正在研究中的抗淀粉样蛋白方法、他丁类、抗炎类以及Caspase抑制剂类等多种药物［6］。可见现在临床上应用的以及正在研究的药物都是针对阿尔兹海默病的一个靶点而设计的。这可能正是现有药物效果不好的原因，本中药复方由35味中药组成，成分复杂，运用 KinexTMAntibody Microarray这种新技术发现这种中药复方能够抑制神经元凋亡、抑制炎症、抑制 tau蛋白的过度磷酸化，提高记忆力。

中药I号方(PN-1)具有抗tau蛋白过度磷酸化的作用。在给药组，Tau蛋白T522磷酸化水平低于空白对照组。阿尔兹海默病病人脑Tau蛋白的磷酸化水平是正常人脑中的3～4倍，这些高度磷酸化的tau表现出了神经元毒性，不仅不能跟微管蛋白结合，也不能促进微管的组装，反而抑制微管的组装并破坏微管，在3×Tg阿尔兹海默病模型鼠中，同时减少可溶性淀粉样蛋白和可溶性高磷酸化的tau能改善模型鼠的记忆力［9］。这表明降低 Tau蛋白的高度磷酸化可能为阿尔兹海默病的一个治疗靶点。PN-1能抑制Tau蛋白的高度磷酸水平来改善阿尔兹海默病模型小鼠的病理生理学表现。

中药I号方(PN-1)具有抗炎作用。在给药组，COX2低于空白对照组。在阿尔兹海默病病人的脑中，炎症瀑布升高，如激活小胶质细胞、促炎因子、急性期蛋白和补体蛋白，研究表明阿尔兹海默病病人脑中 COX2的水平是升高的［10］。在脑中，COX2是一种促炎因子［11］。动物实验表明抑制 COX2能提高小鼠的记忆力［12］。这表明PN-1可以通过抑制炎症反应来改善阿尔兹海默病模型小鼠的病理生理学表现。

中药I号方(PN-1)具有抑制细胞凋亡的作用。在给药组Caspase6和Caspase9低于空白对照组;而抗凋亡蛋白Bcl-xl，在给药组高于空白对照组。阿尔兹海默病病人病理表现之一是神经元凋亡［3］，神经元凋亡需要大量的caspase，到现在为止共有13类Caspase［13］。这表明 PN-1可能通过抑制细胞凋亡来改善阿尔兹海默病的病理生理学表现。

中药 I号方(PN-1)具有提高记忆力的作用。在给药组，CaMK4水平高于空白对照组。阿尔兹海默病病人的主要临床表现是进行性记忆力下降。研究发现CaMK4是记忆形成的正调节因子，他水平的升高能提高老年鼠的记忆力［14］。这表明PN-1可能通过提高记忆力来改善阿尔兹海默病的病理生理学表现。

以往的实验研究发现中药I号方(PN-1)能够减少给药模型鼠脑内老年斑沉积，降低脑内Aβ水平，促进给药模型鼠脑内突触信号转导蛋白水平的增加，提高给药鼠的记忆力［7］。这表明中药 I号方(PN-1)能通过多靶位改善阿尔兹海默病的病理生理表现，这为多靶位药物的研发提供了基础。

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