姜黄素对肝星状细胞JAK2－STAT3信号通路的影响＊

郑旭锐 樊英华 韦永红 宋 健 曹 宁 王礼凤 应小平 惠 毅

陕西中医学院（咸阳712046）

姜黄素（Curcumin，Cur）是从中药姜黄中提取的一种酚类色素，其具有抗肿瘤、抗氧化、保肝等广泛的药理作用，本实验观察姜黄素对肝星状细胞（HSC－T6）JAK2－STAT3信号通路转导的影响。

1 实验材料及方法

1.1 实验材料 ①重组瘦素蛋白（为美国Protech公司生产）；②actin及化学发光试剂（购自北京中山公司）；③RPMI－1640培养基（美国Gibco公司生产）；④山羊抗兔二抗、JAK2、STAT3（均为北京博奥森生物技术有限公司生产）；⑤10%胎牛血清（杭州四季青生物制品有限公司生产）；⑥HSC－T6（购自上海肯强仪器有限公司）。

1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养方法：培养基：RPMI－1640＋10%胎牛血清。培养液：37.0C carbon dioxide（CO2），5%。①弃去培养液，用PBS（不含钙，镁离子）洗1～2次；②加1mL消化液（0.25%Trypsin－0.53mM EDTA）于培养瓶中，倒转放于37度培养箱1～3min预热，然后又将培养瓶倒转大约30s后，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆分散，轻敲几下培养培养瓶，细胞随即脱落下来；③加入6～8mL完全培养基，吸出，分到新的培养瓶中。每2d传代1次。

1.2.2 制备药物血清：姜黄素（购自Sigma公司）；秋水仙碱：西双版纳制药厂生产（批号：C－2284）。Wistar大鼠36 只，雄性，体重180g±20g，清洁级，均购自西安交通大学医学院实验动物中心。

将动物按随机数字表法随机分为3组：正常（A）组、姜黄素（B）组、秋水仙碱（C）组，每组均12只大鼠。①A 组给予相应剂量生理盐水灌胃；②其余2组每日均按1mL／100g药液经胃灌药1次。以上各组大鼠均采用连续灌胃7d的方法。

1.2.3 取材方法：①将各实验组大鼠禁食不禁水12h，在最后一次灌药1h后，每只大鼠（按0.35mL／100g的剂量）用含10%水合氯醛进行麻醉；②麻醉成功后每组动物进行心脏采血（2mL／只）；③用3000r／分的离心机离心分离血清；④在56℃水浴中灭活30min；⑤用0.44um 微孔滤膜过滤后冷藏－20℃冰箱中以备后用。

1.2.4 蛋白印迹试验：按试剂盒说明书操作。

2 结 果

2.1 姜黄素组含药血清对肝星状细胞JAK2蛋白表达影响 与正常组比较，姜黄素组6h、12、24h时间段的蛋白条带颜色均变浅，而且在12h的蛋白条带颜色最浅。见图1。

图1 1～4分别表示姜黄素组0，6，12，24h的蛋白条带颜色

2.2 作用6h后，各组含药血清对增殖后的肝星状细胞中JAK2蛋白表达影响 与正常组比较，姜黄素组、秋水仙碱组蛋白条带颜色均变浅，而姜黄素组蛋白条带颜色与秋水仙碱组比较则未见明显差异（图2）。

图2 姜黄素对增殖后的肝星状细胞的JAK2表达的影响结果

2.3 姜黄素对肝星状细胞STAT3蛋白表达影响 与正常血清组比较，姜黄素药物血清作用6h后，蛋白条带颜色开始逐渐变浅，STAT3表达水平逐渐降低，至24h颜色最浅，表明STAT3蛋白表达水平达到最低（图3）。

图3 1～4分别表示姜黄素0，6，12，24h的蛋白条带颜色

2.4 作用12h后，各组含药血清对增殖后的肝星状细胞中STAT3蛋白表达影响 与正常组比较，姜黄素组、秋水仙碱组蛋白条带颜色变浅，而姜黄素组与秋水仙碱组比较则无明显差异（图4）。

图4 姜黄素对增殖后的肝星状细胞STAT3表达的影响结果

3 讨 论

肝星状细胞（HSC）的激活是导致肝纤维化的一个共同的途径，其共有的表现是HSC转化为肌成纤维细胞，合成大量的细胞外基质（ECM），ECM 在肝脏内大量的沉积，最终导致肝纤维化的形成，故现代医学认为肝纤维化发生的细胞学基础是HSC的活化与增殖［1］。人HSC 活化增殖时Ⅰ型胶原mRNA为静止时的60～70倍［2］，HSC活化增殖，胶原合成增加是肝纤维化形成的直接原因。

现代研究发现瘦素是促肝纤维化细胞因子，它是肥胖基因编码的一种肽类激素，其具有显著诱导HSC 活化和增殖的作用［3］。现有研究表明，HSC 内瘦素受体后信号转导途径主要涉及到JAR－STAT（Janos激酶结合结构域与信号转导和转录激活因子）途径，JAR－STAT 途径仅由JARs和STATs两级信号传递组分构成，当瘦素与其受体结合后，激活JAK 激酶，JAK 酪氨酸磷酸化后与磷酸化受体进一步结合，从而使下游胞浆蛋白STAT 磷酸化，STAT 磷酸化后转入核内，识别并结合到启动因子区瘦素的活化序列或相关序列，调控瘦素的基因转录［4，5］。

姜黄素（curcumin，cur）是从中药姜黄根茎中提取的一种天然有效成分，其具有抗氧化、抗病毒、保肝等广泛的药理作用［6］。我们对于姜黄素的前期研究已经做了姜黄素对于肝纤维化大鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ－C含量及肝组织TGFβ1的影响的研究以及姜黄素治疗慢性乙型肝炎肝纤维化临床疗效观察，证明其有较好的抗肝纤维化的作用［7－10］。

本次研究结果显示：姜黄素能降低肝星状细胞中JAK2、STAT3蛋白的表达，阻断JAK2－STAT3信号转导，说明姜黄素可能是通过降低JAK2、STAT3 蛋白表达，阻断JAK2－STAT3信号转导来实现其抗肝纤维化作用的。

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［6］ 李凯杰，胡锡敏.姜黄素抗肝纤维化机制的研究进展［J］.中国热带医学，2008，2（8）：314－316.

［7］ 孙守才，宋 健，李长秦，等.姜黄素对于肝纤维化大鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ－C含量及肝组织TGFβ1的影响的研究［J］.陕西中医，2007，9（8）：1247－1249.

［8］ 张 航，孙守才，宋 健，等.姜黄素治疗慢性乙型肝炎肝纤维化临床疗效观察［J］.现代中医药，2007，5（27）：3－7.

［9］ 郑旭锐，孙守才，李长秦，等.姜黄素对肝纤维化大鼠肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA 影响的研究［J］.中药材，2007，30（9）：1118－1119.

［10］ 郑旭锐，张选国，宋 健，等.姜黄素对肝纤维化模型肝组织Ⅳ型胶原和转化生长因子β1mRNA 表达的影响［J］.陕西中医，2009，30（6）：749－750.