一种KRAS基因突变检测方法的建立及初步应用

罗凯王倩潘东晓卢敏莹贺智敏★

•论 著•

一种KRAS基因突变检测方法的建立及初步应用

罗凯1王倩2潘东晓1卢敏莹1贺智敏1★

目的建立一种KRAS基因实时荧光定量PCR-Sanger测序突变检测方法，并初步探讨其临床应用价值。方法以KRAS基因热点突变区域12、13密码子为研究位点设计特异性扩增、测序引物，利用已知野生型、突变型样品以TA克隆技术构建相应质粒作为标准品，建立KRAS基因实时荧光定量PCR-Sanger测序突变检测方法，并进行方法学和应用评估。结果成功构建了KRAS基因12、13密码子野生型、突变型质粒。建立了KRAS基因实时荧光定量PCR-Sanger测序突变检测方法，该方法灵敏度高（9.39×101copies/uL），重复性好（实时荧光定量PCR部分批内、批间变异系数分别为1.60%、2.54%）。该法与传统Sanger测序法同时检测40例临床样品，结果符合率为100%。结论本研究成功建立了可用于临床样品检测的KRAS基因实时荧光定量PCR-Sanger测序突变检测方法。

KRAS；突变；基因测序；实时荧光定量PCR

KRAS基因为RAS基因家族中的一员，属细胞内信号传导蛋白类原癌基因，位于人类染色体12 p，含4个编码外显子和1个5'端非编码外显子，共同编码含189个氨基酸、分子量为21 kD的RAS蛋白。RAS蛋白是一种膜结合型的GTP/GDP结合蛋白，可作为分子开关，参与细胞外生长、增殖、分化等信号向胞内传递的过程。当KRAS基因发生突变时可致RAS蛋白异常活化，刺激细胞持续生长或分化，最终导致细胞的恶性转化。在许多肿瘤中KRAS基因的突变率较高，如结直肠癌和非小细胞肺癌中突变率分别可达30～60%[1]和21～28%[2,3,4]。同时在上述两种肿瘤中约80～90%的KRAS基因突变发生在突变热点2号外显子12、13密码子上[5,6]。

目前，NSCLC的酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor, TKI）靶向治疗和转移性结直肠癌的表皮生长因子受体单抗靶向治疗已在临床应用。相关研究表明[7]，存在KRAS基因突变的NSCLC和结直肠癌患者分别对TKI和表皮生长因子受体单抗靶向治疗无反应性。因此检测KRAS基因突变对于指导NSCLC和结直肠癌患者的靶向治疗具有重要意义。

测序法是基因突变检测的“金标准”方法，传统Sanger测序法具有结果准确、重复性好、可检测已知与未知突变的优点，但同时也存在步骤多、耗时长、易污染、灵敏度低等缺点。因此建立一种步骤更简、性能更优的突变测序检测方法十分必要。而实时荧光定量PCR是目前普遍应用的一种快速、灵敏、污染少的基因扩增检测方法[8]。本研究以KRAS基因12、13密码子为靶点，将应用荧光染料（EvaGreen）的实时荧光定量PCR法与Sanger测序法相结合，拟建立KRAS基因突变实时荧光定量PCR-Sanger测序检测方法，并初步探讨其临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 样品

收集2011年9月至2012年8月年广州医学院附属肿瘤医院NSCLC患者肿瘤组织样品20例，其中石蜡切片样品18例，新鲜组织样品2例；男性12例，女性8例；年龄38～89岁，中位年龄55岁。另收集同时期结直肠癌患者肿瘤组织样品20例，其中石蜡切片样品2例，新鲜组织样品18例；男性10例，女性10例；年龄47～77岁，中位年龄60岁。

1.2 试剂和仪器

DNA提取试剂盒为北京天根的口腔拭子基因组DNA提取试剂盒；Taq酶为大连宝生物的Taq HS酶；荧光染料为美国Biotium的EvaGreen；测序试剂为美国ABI的BigDye3.1试剂盒；实时荧光PCR仪为美国ABI的7500Fast；测序仪为美国ABI的3130xl。

1.3 实验引物

依据GENE BANK中KRAS基因的参考序列（NG_007524.1），利用Primer 5.0设计KRAS基因12、13密码子扩增引物，并将下游引物作为测序引物，由上海Invitrogen公司合成。序列如下：上游引物5'CCT GCT GAA AAT GAC 3'，下游引物5'CAA AGA ATG GTC CTG 3'，目的片段长169 bp。

1.4 标准品制备

用设计的PCR引物扩增1例已经测序鉴定为KRAS基因12密码子G12A（GGT＞GCT）突变的结直肠癌组织样品，然后利用美国Thermo的胶回收试剂盒纯化PCR产物，将产物克隆于大连宝生物的PMD-19质粒，挑菌测序鉴定克隆成功与否并分离野生型与突变型质粒分别作为野生型标准品和突变型标准品。增菌培养后美国Thermo质粒提取试剂盒抽提质粒，美国Thermo NANODR 2000超微量分光光度计测定质粒核酸浓度，计算标准品拷贝数。

1.5 性能评价实验

将野生型标准品按10倍倍比稀释为9.39×107copies/uL至9.39×101copies/uL梯度，每个梯度隔天实时荧光定量PCR重复测定3次，每次各梯度做3个复管，3次批间实时荧光定量PCR实验中各随机抽取1组标准品梯度的PCR产物完成后续的Sanger测序实验，以此评估方法的灵敏度、批间和批内重复性。

1.6 样品DNA提取

石蜡切片样品：取石蜡切片6～15片（肿瘤组织含量越高、面积越大，检测用切片数越少），每片滴加1～2滴二甲苯，洁净手术刀片刮取玻片上组织放入含1 mL二甲苯的1.5 mL离心管中，静置10 min，离心去上清。1 mL二甲苯重复样品脱蜡1次，1 mL无水乙醇洗涤样品2次。室温开盖静置待酒精彻底挥发干净。

新鲜组织样品：洁净手术刀对待检样品做4～6点取样放入1.5 mL离心管中，75%酒精洗涤样品一次，弃上清。室温开盖静置待酒精彻底挥发干净。

样品DNA提取：按试剂盒说明书提取样品DNA，超微量分光光度计测定样品DNA含量与纯度。

1.7 实时荧光定量PCR反应及产物纯化

反应体系：TaKaRa TaqHS（5 U/uL）0.125 uL、10×PCR Buffer（Mg2+Plus）2.5 uL、dNTP Mixture（各2.5 mM）2 uL、EvaGreen 1 uL、上游引物（5 pM/uL）2 uL、下游引物（5 pM/uL）2 uL、ddH2O 13.375 uL、样品DNA 2 uL。

反应条件：94℃ 2 min；94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃45 s（采集荧光），45个循环；融解曲线。

产物纯化：取PCR产物5 uL加入2 uL 北京鑫诺SAP酶混合物混匀，37℃ 1 h，80℃ 15 min。

1.8 PCR产物测序

测序反应体系：纯化PCR产物1～3 uL、Bigdye3.1 1 uL、下游引物（5 pM/uL）2 uL，补水至总体积6 uL。反应条件：96℃ 1 min；96℃ 10 s、50℃ 5 s、60℃ 4 min，25个循环；4℃恒温。测序反应产物经醋酸钠乙醇纯化后上机测序。

1.9 测序结果分析

所得序列图采用Chromas2.23软件通过与NCBI基因库KRAS基因标准序列比对，分析测序结果。

1.10 与传统Sanger测序法的比对实验

将上述40例样品同时使用北京鑫诺KRAS基因突变测序检测试剂盒平行检测，实验按试剂盒说明书操作，对比分析结果。

2 结果

2.1 KRAS基因实时荧光定量PCR-Sanger测序突变检测法的建立

以经测序鉴定为KRAS基因12密码子G12A（GGT＞GCT）突变的结直肠癌组织样品DNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增，可见阳性扩增曲线和单一的融解曲线峰（解链温度：80.06）；将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，可见169 bp的单一电泳条带；进行PCR产物测序并分析结果，所测序列与拟检测KRAS目标序列完全相符，同时可见G12A（GGT＞GCT）突变型测序峰图。以上结果表明本研究所采用的引物、反应体系和反应条件是合适的，KRAS基因实时荧光定量PCR-Sanger测序突变检测法已初步建立（图1）。

2.2 标准品的鉴定

构建的野生型重组质粒标准品经测序鉴定插入的169 bp片段与KRAS基因参考序列（NG_007524.1）完全一致，换算浓度为9.39×1010copies/uL。构建的突变型重组质粒标准品经测序鉴定插入的169 bp片段为KRAS基因G12A（GGT＞GCT）突变片段，换算浓度为8.7×1010copies/uL，将原液稀释为8.7×105copies/uL应用液作为后续实验的阳性对照。

2.3 检测范围与灵敏度分析

将野生型标准品按10倍倍比稀释为9.39×109～9.39 ×101copies/uL浓度梯度，取各稀释度做实时荧光定量PCR反应，见图2。由图可见本实时荧光定量PCR体系标准曲线的R2=0.985，而去掉9.3×101copies/uL浓度梯度重新分析，则标准曲线的R2=0.993，可见本荧光定量PCR体系在9.39×109～9.39×102copies/uL范围内线性较好，但检测下限可达9.39×101copies/uL。各野生型标准品梯度PCR产物均成功完成后续测序检测。以上结果显示本KRAS基因实时荧光定量PCR-Sanger测序突变检测方法的灵敏度可达9.39×101copies/uL。

图1 KRAS基因实时荧光定量PCR-Sanger测序突变检测结果Figure 1 The detection results of KRAS gene mutaection by Sanger sequencing combined with Real-time PCR

2.4 重复性分析

对线性范围内9.39×109～9.39×102copies/uL野生型标准品梯度做实时荧光定量PCR体系批内和批间重复性实验，实验结束后设置相同阈值线分析结果，获得各反应曲线的CT值进行重复性分析。结果为：各梯度批内变异系数分别为2.64%、1.69%、1.60%、1.37%、0.62%、1.82%、1.69%、1.78%，平均变异系数为1.60%；各梯度批间变异系数分别为2.20%、2.36%、3.09%、2.13%、1.97%、2.74%、3.23%、2.62%，平均变异系数为2.54%。3次批间荧光定量PCR实验中各随机抽取1组标准品梯度的PCR产物均成功完成后续测序检测。结果表明该法具有良好的重复性。

2.5 比对实验结果

实时荧光定量PCR-Sanger测序法与常规Sanger测序法检测NSCLC、结直肠癌样品共40例，结果完全相符。其中NSCLC患者和结直肠癌患者KRAS基因12、13密码子突变率分别为5%和45%，详见表1。

3 讨论

肿瘤的发生发展是一个多因素调控、多阶段进展的过程，有多种基因参与肿瘤细胞的生长、增殖、分化与凋亡。其中KRAS基因编码的RAS蛋白是细胞外信号向胞内传导的信号通路网络中的主要蛋白之一，其可作为分子开关参与细胞增殖、分化、凋亡的调控，KRAS基因突变会导致RAS蛋白的异常活化，从而持续激活RAS-Raf-MEK-ERK等信号通路，导致细胞异常增生，促进肿瘤形成[9,10]。故KRAS基因是近年来肿瘤靶向治疗领域的热门研究靶点之一，其突变也会影响相关靶向药物的疗效。NCCN肿瘤学临床实践指南中国版（2009）指出NSCLC患者KRAS基因突变与TKI治疗耐药有关，检测KRAS基因突变有助于应用TKI治疗患者的选择；转移性结直肠癌患者也应检测KRAS基因状态，KRAS基因突变型患者提示EGFR单抗靶向治疗无效。因此，准确、有效的检测KRAS基因突变已成为临床的常规需求之一。

目前，基因突变的检测方法主要包括Taqman实时荧光PCR法、探针扩增阻滞突变系统、蝎型探针扩增阻滞突变系统、高分辨率溶解曲线分析法、PCR-单链构象多态性法和测序法等多种方法，其中测序法为金标准方法，并已应用于临床基因突变检测。测序法检测基因突变具有重复性好、准确度高、可检测已知与未知突变、可明确具体突变类型等优点，但同时也存在步骤多、耗时长、易污染、灵敏度低等缺点[11]。

图2 A：各浓度梯度标准品实时荧光定量PCR扩增曲线图。B：定量标准曲线

表1 临床样品KRAS基因12、13密码子突变检测结果Table 1 Clinical samples KRAS gene codon12 and codon13 mutation test results

传统的Sanger测序法利用定性PCR结合琼脂糖电泳模式对目的片段进行扩增与扩增效果鉴定，然后再对扩增产物进行序列测定。该模式存在一些弊端影响临床应用，主要包括：1、步骤繁琐，耗时长。2、电泳时易产生大量PCR产物气溶胶造成污染引起假阳性。3、电泳检测的灵敏度较低，低浓度样品易漏检。4、无法对样品模板浓度定量，导致高拷贝样品在测序反应时因加入过多的PCR产物而出现异常测序峰图影响突变结果的判读。本研究建立的KRAS基因实时荧光定量PCR扩增体系通过分析样品荧光反应曲线即可判断扩增是否成功，同时可利用融解曲线监测反应的特异性，相较传统定性PCR结合琼脂糖电泳模式来说，不仅步骤简化、时间缩短，还避免了电泳时可能产生的大量产物气溶胶所造成的污染。同时，结合荧光染料的实时荧光定量PCR无需设计合成特殊探针而仅需加入荧光染料即可实现对样品的实时、定量检测，故成本低廉且可有效指导后续测序反应步骤产物加样量而得到理想的测序峰图。王征等[12]报道，PCR产物琼脂糖电泳鉴定的检出下限仅达103copies/uL，本研究建立的实时荧光定量PCR的检测下限达9.39×101copies/uL高于电泳鉴定，且检测下限反应管的PCR产物量同时满足后续测序步骤的实验要求，故本研究建立的实时荧光定量PCRSanger测序法的检测下限可达9.39×101copies/uL，较传统Sanger测序法能更好地检出低浓度样品。

相关研究报道[13,14,15]中国人中NSCLC、转移性结直肠癌患者的KRAS基因突变率分别约为8～13%和30%。本研究使用实时荧光定量PCR-Sanger测序法检测NSCLC、转移性结直肠癌各20例样品的KRAS基因突变，突变率分别为5%和45%，与相关报道基本相符。本研究还利用基于传统Sanger测序法的KRAS基因突变商品化检测试剂盒平行检测同批样品，两法结果完全相符。表明本研究建立的实时荧光定量PCR-Sanger测序法可用于临床样品的KRAS基因突变检测。

本研究所建立的KRAS基因实时荧光定量PCRSanger测序突变检测方法相对传统Sanger测序法具有步骤简化、时间缩短、污染减少、灵敏度提高和可定量检测样品浓度等优点，具有较好的临床应用价值，可为指导相关肿瘤的靶向治疗工作提供有效的技术支持。

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Establishment of a method about detecting KRAS gene mutations and its application

LUO Kai1, WANG Qian2, PAN Dongxiao1, LU Minying1, HE Zhimin1★
(1.Guangzhou Medical University Cancer Institute and Hospital, Guangdong, Guangzhou 510095, China; 2. Pathology Department, Guangzhou Hospital of TCM, Guangdong, Guangzhou 510130, China)

Objective To establish a method about detecting KRAS gene mutations through Sanger sequencing combined with Real-time PCR and evaluate its clinical value. Methods A KRAS gene mutations detection method through Sanger sequencing combined with Real-time PCR was established with specific primers targeting the hotspot mutation region (codon12 and codon13), and wild-type plasmid and mutant plasmid were constructed as the standard samples. Then the performance and application of method were assessed. Results

The standard plasmids were constructed successfully. A KRAS gene mutations detection method through Sanger sequencing combined with Real-time PCR was established successfully which owned high sensitivity (9.39×101copies/uL) and good repeatability(intra-assay CV and inter-assay CV of the Real-time PCR were 1.60% and 2.54%, respectively). There was no difference between traditional Sanger sequencing and Sanger sequencing combined with Real-time PCR to detect KRAS gene mutations in 40 clinical samples. Conclusion The established mutation detection method through Sanger sequencing combined with Real-time PCR can be used in clinical samples to detect KRAS gene mutations.

KRAS; Mutation; Gene sequencing; Real-time PCR

1.广州医学院肿瘤研究所，广州医学院附属肿瘤医院，广东，广州，510095 2.广州市中医院病理科，广东，广州，510130