肢体缺血-再灌注对心肌的影响

何平

肢体缺血-再灌注(LIR)不仅可以造成缺血组织严重损伤，而且可致心肌损伤。本试验观察LIR所致心肌损伤的影响，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 标本:健康雄性Wistar大鼠，体重210～260 g，由本院动物中心提供。自由进食、饮水，自然光照，室温(25.2±2.0)℃，分笼常规喂养。

1.2 试剂 丙二醛(MDA)试剂盒，黄嘌呤氧化酶活力(XOD)试剂盒，超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物制品公司)。

1.3 方法

1.3.1 动物分组 动物随机分为2组，每组10只。①IR组:按模型操作。②对照组(Control组):橡皮带松弛环绕肢体，不阻断血流，其余操作同IR组。

1.3.2 模型制备及标本采集:Wistar大鼠试验开始前需禁食12 h，允许自由饮水。采用我科室常规方法［1］复制大鼠LIR模型:经乙醚浅麻醉下，用适度松紧的橡皮带环绕结扎大鼠双后肢根部以阻断血流4 h，松解橡皮带再恢复血流灌注2 h。各组动物在再灌注2 h时穿刺腹主动脉取血并提取组织标本，血液经3 500 r/min离心15 min，所得血浆标本分装在干净的Eppendorf管中，－70℃保存备用。同时立即开胸取出心脏，迅速纵向剖开左心室，冷磷酸盐缓冲液(PBS)充分冲洗，用滤纸吸干表面水分，液氮速冻，－70℃储藏备用。此外，每组随机取5份新鲜心脏标本，于心尖部位横断面切取组织块(长约0.5 cm)迅速投入10%甲醛溶液中固定，次日更换固定液，石蜡包埋后备用。

1.3.3 观测指标

1.3.3.1 10%心肌组织匀浆的制备:应用扭力天平称取已冻存的心肌组织200 mg，在蜡板上用眼科剪将其细细剪碎，移入装有2 ml冷0.9%氯化钠溶液的匀浆管中，冰浴条件下电动匀浆3 min。匀浆液经3 500 r/min离心15 min后，收集上清液，测定所需要的心肌组织各项生化指标。

1.3.3.2 心肌组织MDA的测定:①测定原理:MDA是过氧化脂质降解的产物，它可与硫代巴比妥酸(TBA)缩合形成一种红色物质，此物质在532 nm处有最大吸收峰，通过对此物质的测定，可推算出MDA的含量。②测定方法:旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧并用针头刺一小孔，95℃水浴(或用锅开盖煮沸)40 min，取出后流水冷却，然后3 500～4 000 r/min，离心10 min。用移液器吸取上清，532 nm处、1 cm光径、蒸馏水调零测各管吸光度值。见表1。③计算公式:组织MDA(nmol/mgprot)=×标准品浓度(10nmol/ml)÷组织中蛋白含量(mgprot/ml)。见表1。

表1 心肌组织MDA测定方法

1.3.3.4 心肌组织SOD的测定:①测定原理:黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统可产生超氧阴离子自由基，此物质可氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下显示紫红色，用可见光分光光度计可测其吸光度值。SOD是自由基清除酶，被测样品中含有的SOD对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，可使形成的亚硝酸盐减少，紫红色显色物含量减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管。通过公式计算可求出被测样品的SOD活力。②测定方法:混匀，室温放置10 min，550 nm处，1 cm光径，蒸馏水调零，比色读取吸光度值(OD)。见表3。③SOD活力计算:单位定义:每毫克组织蛋白在1 ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U)。=计算公式:组织SOD(U/mgprot)=50% ×组织中蛋白含量(mgprot/ml)。见表3。

表2 心肌组织XOD测定方法

表3 心肌组织SOD测定方法

1.4 统计学分析应用SPSS 11.5统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

IR组动物心肌组织MDA、XOD、SOD水平与Control组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表4。

表4 2组心肌组织观察指标水平比较n=10，±s

表4 2组心肌组织观察指标水平比较n=10，±s

注:与 Control组比较，*P ＜0.01

组别 MDA(nmol/mgprot) XOD(U/gprot) SOD(U/mgprot)Control组5.0 ±0.4 68 ±10 19.9 ±1.0 IR 组 7.7 ±0.8* 83 ±5* 12.5 ±1.6*

3 讨论

组织、器官的IR除可造成组织、器官本身严重的病理改变外，伴随着机体内环境的破坏，代谢的紊乱，损伤还可由局部波及远端脏器。LIR在引起缺血肢体损伤的同时，也可继发其他远隔组织器官的病理变化［2］，严重时引起多器官功能障碍综合征［3］(MODS)，心肌的损伤便是MODS的重要表现之一。

3.1 心外因素造成心肌组织损伤的实验依据 研究表明，机体经受严重创伤、严重感染、缺血再灌注损伤等剧烈应激反应时，心脏可能发生可逆转或不可逆转的损伤性变化［4］。姚季生等［5］经尾静脉给大鼠注射去甲肾上腺素，发现心肌有多灶性坏死且病灶内心肌深嗜伊红性改变，部分肌原纤维断裂溶解等病理改变。在下肢IR中，心、肺是最易受累的远位靶器官［6］。有文献报道，LIR引起的氧化应激反应可造成肺水肿甚至呼吸功能障碍［7］。遭受一段时间缺血损伤的肢体，恢复血液灌流后不仅发生局部骨骼肌的再灌注损伤(reperfusion injury，RI)，机体还可能出现血压进行性降低的全身应，称为止血带休克(tourniquet shock，ToS)。Jesse等［8］对止血带引发休克进行研究时发现，止血带使用3 h以上休克发生的可能性极大。任会荣等［9］建立肢体束缚应激动物模型，也观察到心肌线粒体膜明显的损伤变化。骨骼肌细胞缺血一定时间后恢复血流灌注，细胞损伤胞浆内容物释放入血，血液性状及成分明显异常［10］。心脏是接受下肢血液回流的第一站。再灌注血液经下腔静脉到右心房再灌流全心，缺血期生成的毒性代谢产物及再灌注期形成的大量炎性介质，会随着再灌注血流到达心脏并进一步播散到全身。心脏需氧量大，能量代谢过程复杂，下肢的IR可经多种机制影响心肌的代谢和功能活动，造成心肌组织损伤。

3.2 氧自由基的损伤作用 氧自由基化学性质较为活泼，可破坏机体正常氧化/还原的动态平衡，形成严重的氧化应激(oxidative stress)状态，对生物大分子(核酸、蛋白质、脂质)造成过氧化性损伤，影响正常的生命活动。LIR过程中体内有大量的自由基产生，这可作为缺血再灌注造成远位器官损伤的主要机制。其中氧自由基(OFR)可通过级联反应损伤心肌细胞膜及心脏血管内皮细胞。MDA性质稳定，是OFR攻击膜性成分多不饱和脂肪酸的终产物，它还可以进一步引起蛋白质、磷脂和核酸的交联而加重组织损伤。组织MDA水平可作为反映自由基损伤程度的指标［11］。XOD是生成OFR的催化酶，其在催化次黄嘌呤及黄嘌呤代谢的过程中，有大量超氧阴离子(O2产生。SOD是一种金属蛋白，可以歧化O2生成 H2O2并可进一步清除 H2O2，是体内主要的酶性自由基清除剂。MDA、XOD、SOD可作为机体脂质过氧化损伤程度的间接指标。实验结果显示:与Control组比较，在经受LIR的2组心肌组织中SOD含量降低(P＜0.01)，而XOD和MDA含量均明显增加(P＜0.01)，提示心肌组织中自由基产生过多，心脏及整个机体处于氧化应激状态。SOD含量的降低与缺血缺氧使其生成不足［12］和清除自由基时消耗过多有直接关系。氧自由基相关指标说明了LIR造成心肌损伤。

综上所述，大鼠LIR可引起心肌损伤。机体的氧化应激状态可能是LIR继发心脏损伤的主要机制之一。

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