稻草补饲苜蓿对山羊瘤胃动力学及 十二指肠氨基酸流量影响的研究

张吉鹍，张震宇，吴文旋，李龙瑞，邹庆华

(1.江西省农业科学院畜牧兽医研究所，江西 南昌 330200；2.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018；3.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；4.江西新天地药业有限公司兽药研究院，江西 峡江 331400)

山羊饲喂稻草基础日粮并补饲适量的苜蓿，由于饲料间的组合效应，提高了稻草在瘤胃的发酵率、消化道各部位营养物质流通量与微生物蛋白的合成效率以及山羊氮的沉积率。但当稻草基础日粮补饲的苜蓿超过50%，由于可发酵有机物的不足而发生能氮不配对发酵，使得补饲苜蓿对提高稻草基础日粮氮利用效率的组合效应降低[1–2]。谭支良[3]研究了绵羊日粮中结构性碳水化合物(SC)与非结构性碳水化合物(NSC)的比例、过瘤胃蛋白(UDP)与瘤胃降解蛋白(RDP)比例及其相互作用对瘤胃动力学及日粮营养物质在十二指肠的流通量，但未就十二指肠氨基酸的流量进行研究。卜登攀[4]的研究证明，提高日粮的能氮同步性，可增加瘤胃的液相流通速率，促进瘤胃微生物的合成，提高十二指肠食糜氨基酸的流量。笔者在研究山羊稻草基础日粮补饲不同水平苜蓿对消化道各部位营养物质流通量影响[2]的基础上，进一步研究苜蓿补饲水平对瘤胃动力学参数、十二指肠氨基酸流量的影响，旨在从十二指肠氨基酸流量与氨基酸组成模式进一步探讨山羊稻草基础日粮补饲苜蓿增加瘤胃微生物氮利用效率的组合效应机理。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选9 只体况良好，体重相近((41.3±1.2) kg)，安装有永久性瘤胃瘘管、十二指肠瘘管、回肠瘘管的成都麻羊半同胞羯羊进行试验。

1.2 试验设计

根据前期体外批次发酵的组合效应研究结果[5]，决定在山羊稻草基础日粮中分别补饲25%、50%与75%的苜蓿，即将稻草与苜蓿干草(MSL)分别以75∶25(MSL25)、50∶50 (MSL50)与25∶75(MSL75) 的比例组成3 个混合粗饲料，并制成草块。

试验采用单因子3 处理重复设计，按体重相似和随机方法将试验羊只分成3 组，每组3 只，分别饲以3 组混合粗饲料，以探讨山羊稻草基础日粮补饲不同水平苜蓿(25%、50%与75%)对山羊瘤胃动力学参数、十二指肠氨基酸流量的影响。

试验羊单笼饲养，预试期14 d，正试期7 d，每日于6：00 和18：00 饲喂，自由饮水，常规光照、驱虫与管理。

1.3 消化道食糜流通量测定

1.3.1 标记物制备

选用Co–EDTA 为食糜标记物，根据Uden 等[7]的方法制备：称取25 g 乙酸钴、29.2 g 乙二胺四乙酸和4.0 g 氢氧化钠放入2 L 烧杯中，加入200 mL蒸馏水，加热至80 ℃溶解，冷却后再加入20 mL 30%过氧化氢溶液，室温放置4 h 后，加入300 mL 体积分数为95%的乙醇溶液，置于冰箱12 h 后，经定性滤纸过滤并用体积分数为85%的乙醇溶液冲洗数遍。收集滤纸上粉红色物质于瓷盘中，置于100 ℃烘箱中烘干即可。实测该Co–EDTA 标记物Co 含量为14.08%。

1.3.2 灌注液配制

启动灌注液配制：称取Co–EDTA 3.6 g 定容至1 200 mL，质量浓度约为4.20×10–4g/L。

连续灌注液配制：称取Co–EDTA 20 g 定容至70 L，质量浓度约为4.0×10–5g/L 。

1.3.3 标记物的灌注及采样

预试期结束后，在正试期的第1 天早晨8:00 开始启动灌注。将100 mL 启动灌注液通过注射器经采样管迅速注入瘤胃内不同位点。灌注完毕后，用采样管尽量充分搅匀瘤胃液，并抽取瘤胃液反复冲洗采样管和注射器，冲洗瘤胃液应及时灌回瘤胃内，紧接着进行连续灌注。连续灌注采用一次性输液器进行，调整流速约为1.40 mL/min，每天灌注连续灌注液2 000 mL，连续灌注7 d。从连续灌注的第5 天开始，采集瘤胃、十二指肠食糜样本。采集方法是拔掉瘘管塞，使食糜自动流出，并收集于塑料采样瓶内。每日采样4 次，连续采集3 d。每日采样时间交替变化，每隔6 h 采集瘤胃食糜50 mL，十二指肠食糜15 mL。采样时间点，第1 天：01：00、07：00、13：00、19：00；第2 天：03：00、09：00、15：00、21：00；第3 天：05：00、11：00、17：00、23：00。

将3 d 内不同时间点采集的瘤胃、十二指肠食糜等量混合制成混合样本，冷冻干燥，以备测其中的干物质(DM)、总氮、Co 浓度和氨基酸等成分。

1.4 测定方法

1.4.1 混合样本干物质(DM)的测定

按照文献[8]方法进行。

1.4.2 Co 的测定

瘤胃液相Co 的测定：取10 mL 瘤胃液于4 000 r/min 离心10 min，取上清液直接上机测定。食糜Co 浓度测定：称取食糜样品约0.5 g，放入25 mL坩埚中，置于马福炉内，在400 ℃下灼烧2 h，冷却后加入3 mol/L HNO3和3mol/L HCl 溶解所得灰分，过滤，将滤液定容至25 mL。取滤液，用原子吸收光谱仪进行Co 的测定。

1.4.3 十二指肠食糜微生物蛋白质测定

采用Zinn 等[9]建立的嘌呤法测定。

1.4.4 氨基酸测定

将食糜冻干样在6 mol/L HCl 下水解22 h 后，减压蒸干，用0.02 mol/L HCl 重新溶解定容后，用日立835 型氨基酸自动分析仪测定。

1.5 计算方法

1.5.1 食糜流通量的计算

先拟合出瘤胃食糜标记物中钴浓度(Ct)与时间(t)的递降曲线Ct=C0×e–kt，计算出停止灌注标记物时瘤胃食糜中初始标记物浓度C0和瘤胃食糜流通速率常数Kp 值(即曲线的K 值，也就是瘤胃液相小数稀释率)，按下列公式进行相关指标的计算。 瘤胃液相食糜流通速率F(L/h)，

十二指肠食糜流通量QD(g/d)，

1.5.2 瘤胃液相体积

瘤胃液相体积V(L)，

1.5.3 食糜内养分流通速率

食糜内养分流通速率(mg/h)=食糜内养分浓度×食糜流通速率。

1.5.4 微生物氮(MN)流通量

微生物氮(MN)流通量(QMN)(g/d)

1.5.5 氨基酸流通量

氨基酸流通量(DFAAi)(g/d)，

DFAAi=CDAAi×QD

式中：DFAAi 为十二指肠食糜中第i 种氨基酸流通量；CDAAi 为第i 种氨基酸含量；QD为十二指肠食糜流通量。

1.6 统计分析

用SAS(6.12)软件的一般线性模型(GLM)程序进行方差分析和邓肯氏多重比较。

2 结果与分析

2.1 稻草补饲苜蓿对山羊瘤胃动力学及微生物蛋白合成的影响

稻草补饲不同水平苜蓿后，山羊瘤胃液相小数稀释率、瘤胃液相外流速率、瘤胃液相体积、瘤胃液相MCP 库容量、MCP 流通速率及MCP 流通量见表1。由表1 可知，稻草补饲苜蓿对瘤胃液相小数稀释速率影响不显著(P＞0.05)，但对液相外流速率、瘤胃液相体积及微生物蛋白质合成的影响在一些组间差异显著(P＜0.05)。3 个试验组瘤胃小数稀释速率基本接近。瘤胃液相外流速率、MCP 流通速率均以MSL50 最高，MSL75 与之接近，MSL25 最低，与MSL50、MSL75 的相应值差异均显著(P＜0.05)。瘤胃液相体积亦以MSL50 的最高，要显著高于MSL75 与MSL25 的(P＜0.05)，其中MSL75与MSL25 的组间差异不显著(P＞0.05)。瘤胃液相MCP 库(细菌氮合成–流出后的净平衡值)容量随MSL 补饲水平的增加而增加，但MSL50 与MSL25、MSL75 的差异不显著(P＞0.05)，其余组间差异显著(P＜0.05)。MCP 流通量亦随MSL 补饲水平的增加而增加，其自高到低的排序为MSL75、MSL50、MSL25，其中MSL75 与MSL50 的组间差异不显著(P＞0.05)。

表1 山羊稻草基础日粮补饲不同水平苜蓿的瘤胃动力学参数及微生物蛋白质流通量

2.2 稻草补饲苜蓿对山羊十二指肠含氮物质流通量的影响

稻草补饲不同水平苜蓿，山羊十二指肠含氮物质流通量见表2。由表2 可知，MSL25、MSL50 与MSL75 的十二指肠微生物氮流量、十二指肠非微生物氮流量均随MSL 补饲水平的增加而增加，差异显著(P＜0.05)。微生物氮占总氮的百分比(MN/TN)亦随MSL 补饲水平的增加而增加，但MSL50 与MSL25、MSL75 的差异不显著(P＞0.05)，其余组间差异显著(P＜0.05)。MSL50 的微生物氮流量较MSL25 提高6.27%，MSL75 较MSL50、MSL25 则分别提高4.04%与10.56%，而MSL50 的MSL 补饲量是MSL25 的2 倍，MSL75 的MSL 补饲量则分别为MSL50、MSL25 的1.5 倍与3 倍，表明稻草基础日粮补饲苜蓿的山羊十二指肠微生物氮流量随MSL 补饲水平的增加呈降低的趋势，当超过50%时，出现拐点。十二指肠非微生物氮流量、十二指肠微生物氮流量占总氮流量的百分比亦呈现类似的变化。

表2 山羊稻草基础日粮补饲不同水平苜蓿的十二指肠含氮物质流通量

2.3 稻草补饲苜蓿对进入十二指肠食糜内氨基酸流量的影响

稻草补饲不同水平苜蓿对山羊十二指肠食糜内必需氨基酸(EAA)与非必需氨基酸(NEAA)流量的影响见表3、表4。由表3、表4 可知，稻草补饲不同水平苜蓿对进入十二指肠食糜内各种氨基酸、总必需氨基酸(TEAA)、总非必需氨基酸(TNEAA)以及总氨基酸(TAA)均有显著影响(P＜0.05)。除个别氨基酸及总必需氨基酸外，总的趋势是补饲苜蓿水平越高，氨基酸的流量越高，差异显著(P＜0.05)。除苜蓿蛋白含有较高的EAA[9–10]外，亦与补饲MSL增加了瘤胃细菌蛋白质产量有关[1]。细菌蛋白质富含Arg、Leu、Lys、Ile、Thr、Gly、Glu 和Ala 等氨基酸[11–12]，本试验中Arg、Leu、Lys、Ile、Thr、Gly、Glu 和Ala 流量均受MSL 补饲的影响，这是因为补饲苜蓿提高了微生物氮流量，因此这几种氨基酸流量的增加可能主要与进入十二指肠的瘤胃细菌蛋白质合成量提高有关。由于十二指肠内氨基酸的流量不仅来自日粮的过瘤胃蛋白(UDP)和瘤胃MCP，同时也有内源氨基酸的贡献，如脱落的细胞及细胞分泌等，故有关苜蓿补饲对进入小肠的氨基酸数量与平衡方面的研究还有待进一步深入。

表3 山羊稻草基础日粮补饲不同水平苜蓿的十二指肠食糜必须氨基酸流量 g/d

表4 山羊稻草基础日粮补饲不同水平苜蓿的十二指肠食糜非必须氨基酸流量 g/d

3 讨 论

a.适量补饲苜蓿，可增加山羊瘤胃微生物蛋白流量。液相流通速率是水、可溶性饲料成分和被微生物降解的可溶性养分的流通速率。含氮物质和能量载体物质在瘤胃降解及二者被微生物整合利用状况，除与微生物对其分解程度有关外，还与流通速率有关。流通速率快时，微生物周转加快，对饲料的降解率降低，过瘤胃比例提高。由于流通速率的增加，日粮同步性高而流通速率快，则可减少瘤胃内能量和氮素的再循环，减少微生物细胞自溶和维持需要，从而能增加进入小肠的MCP 流量[4]。本研究MCP 流通量随MSL 补饲水平的增加而非线性增加，且MSL75 与MSL50 的组间差异不显著，表明山羊稻草基础日粮补饲苜蓿，可以改善日粮的能氮平衡，增加MCP 的合成量，同时还表明，补饲苜蓿要适度，超过这个“度”(本研究为50%)，改善日粮能氮平衡、增加MCP 产量的组合效应不明显。 b.适量补饲苜蓿，可增加山羊十二指肠氨基酸流量 。本研究3 组混合粗饲料的十二指肠微生物氮流量为3.03～3.35 g/d，平均为3.20 g/d，这在其他学者报道的范围之内[4，13–14]。瘤胃每天MCP 总产量与瘤胃可利用能密切相关[15–16]，反刍动物秸秆基础饲料补饲苜蓿可以促进纤维分解菌的生长，从而提高秸秆的消化率[17]，增加了稻草中的可发酵物质，使得能氮更趋平衡，从而增加了瘤胃MCP 的产量，也就增加了进入十二指肠微生物蛋白的流量，进而增加了十二指肠的氨基酸流量，但这种增加并非随稻草基础日粮中苜蓿的增加而线性增加，当MSL 补饲量超过50%时，总必需氨基酸流量的增加不显著，一些氨基酸的流量甚至减少。表明继续增加MSL 补饲量，由于可发酵有机物的不足会导致能氮不平衡而减少十二指肠氨基酸流量的增幅，造成优质干草苜蓿的浪费。

[1]张吉鹍，李龙瑞，吴文旋，等．稻草补饲苜蓿对山羊部分血液生化指标及氮代谢的影响研究[J]．江西农业大学学报，2013，35(5)：待发表．

[2]张吉鹍，张震宇，吴文旋，等．山羊稻草基础日粮补饲不同水平苜蓿对消化道各部位营养物质流通量的影响研究[J]．江西农业大学学报，2013，35(6)：待发表．

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