Annexin A2的表达上调及其23位酪氨酸磷酸化促进乳腺癌细胞MCF-7的增殖和侵袭

王宇晴，张 飞，田 然，孙秀梅，刘 媛，王智勇,牛瑞芳

（天津医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所，天津市肿瘤防治重点实验室，乳腺癌防治教育部重点实验室，天津300060）

Annexin A2（以下称Anxa2）是一种膜联蛋白，能够通过调节细胞外各种蛋白水解酶的相互作用影响肿瘤的侵袭和转移过程[1-2]。Anxa2非折叠且高度分化的N端结构域有两个磷酸化位点，即23位的酪氨酸和25位的丝氨酸[3]。有报道称，第23位酪氨酸的磷酸化对于Anxa2由细胞质向细胞膜的聚集及其调节胰腺癌细胞的侵袭和迁移至关重要[4-5]。为研究Anxa2及其23位酪氨酸磷酸化在乳腺癌细胞的粘附、增殖、迁移和侵袭等活动中所起作用，对Anxa2基因第23位酪氨酸进行了不同活性状态的突变，观察Anxa2及其23位酪氨酸的磷酸化状态对乳腺癌细胞MCF-7生物学特性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、菌种与质粒 293T细胞、MCF-7细胞均购自美国ATCC（Amercian Type Culture Collection）细胞库，293T用DMEM HIGH GLUCOSE培养基+10%的 FBS（Hyclone）培养，MCF-7用 RPMI-1640培养基+10%的 FBS（Hyclone）培养；DH5α 感受态细胞购于北京全式金公司；pEGFP-N3-Anxa2、pCDH、慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G均购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心。

1.1.2 酶、药物、试剂及抗体 限制性内切酶Xho1、Not1、BagII、BamH1、T4DNAligase, 购 自 Fermentas公司；Phusion热启动‖高保真DNA聚合酶购于Thermo公司;DpnI购自Bio Labs公司。卡那霉素、氨苄霉素、嘌呤霉素、MTT及其他化学药品均购自Sigma。质粒提取试剂盒购自QIA GEN公司；凝胶回收试剂盒购自Takara公司；Lipofectamine2000购于Invitrogen公司；transwell小室（0.45 μm）购自美国Millipore公司；β-Actin，GFP，Anxa2的小鼠单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司。

1.2 方法

2.2 重组慢病毒质粒pCDH-EGFP-Anxa2及其突变体的鉴定 提取Anxa2突变体的慢病毒质粒进行Bgl II、Not I双酶切验证，酶切结果经电泳显示为1 kb片段和4.7 kb片段两条（图2），与预期一致，表明Anxa2突变体已经成功插入pCDH载体。测序结果显示，重组质粒中插入的Anxa2及其突变体序列，除突变位点外，其余均未发生突变。

Tyr-Ala-F：5′-AGTGCAGCTGGGTCTGTCAAA GCCTATACTAAC-3′，Tyr-Ala-R：5′-CAGCTGCACT TGGGGGTGTAGAGTGATC-3′；Tyr-Asp-F：5′-AGT GCAGATGGGTCTGTCAAAGCCTATACTAAC-3′，T yr-Asp-R：5′-CATCTGCACTTGGGGGTGTAGAGT GATC-3′（下划线部分为突变位点）。引物由北京六合华大基因公司合成。PCR体系为：质粒pEGFP-N3-Anxa230 ng，上下游引物各 15 pmol，dNTP 10 pmol，Phusion DNA Polymerase 0.5 μL，5xPhusion GC buffer 10 μL，去离子水补充到 50 μL。PCR 条件为：变性98℃，45 s；98 ℃，10 s，70℃，3 min；25 个循环，72 ℃，10 min冷却至4℃。PCR产物经DpnI酶消化后，转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取单克隆，提取质粒送交上海英俊基因测序公司测序。

2.1 pEGFP-Anxa2突变体的鉴定 挑取5个Anxa2的突变体克隆进行测序，测序结果表明5个克隆的质粒都分别在第23个密码子处发生了突变（TAT-GCT，TAT-TGG），其他地方则未发生突变，成功将23位酪氨酸突变为丙氨酸和天冬氨酸（图1）。

需求情况：氮肥方面，农业需求总体清淡，各地基本无用肥需求；工业需求一般，下游按需采购，胶板厂受环境污染治理等工作影响，复合肥企业淡季检修，开工率均呈现下降趋势，对尿素采购需求减少。磷肥方面，国内西北地区冬储市场已启动，甘肃地区厂家已将订单签订至次年2月份；长江和云南地区企业仍以出口市场为主，集港发运较快，新订单零星。钾肥方面，复合肥企业开工率下降，对钾肥采购需求减少。复合肥方面，华北地区秋季备肥市场扫尾，华东地区秋季备肥可持续到10月底，南方果蔬用肥需求展开，基层刚性农需释放。

1.2.3 感染及验证 用上述步骤中包装产生的慢病毒颗粒辅以阳离子聚合剂Polybrene（Sigma）感染人乳腺癌细胞MCF-7，用含有Puromycin的培养基筛选稳定转染的细胞克隆，并用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况，用Western blot和免疫荧光技术验证稳定转染的细胞中Anxa2及其突变体的表达情况。Western blot和免疫荧光的步骤如前[6]。

2.3 重组慢病毒质粒在人乳腺癌细胞MCF-7中稳定表达 人乳腺癌细胞系MCF-7经慢病毒颗粒感染后经嘌呤霉素（4 μg/mL）筛选获得稳定细胞株克隆Anxa2-WT、Anxa2-Y23A 和 Anxa2-Y23D（图 3）。Western blot结果显示，GFP蛋白仅在Anxa2-WT、Anxa2-Y23A和Anxa2-Y23D中表达，在MCF-7及其对照组细胞中不表达（图4）；对Anxa2-WT和MCF-7行免疫荧光检测表明，Anxa2-WT的红色荧光明显比MCF-7的细胞亮（图5）。表明Anxa2及其突变体在MCF-7细胞中稳定表达。

1.2.6 Transwell检测细胞的侵袭能力 配备浓度为5×105个/mL的无血清细胞悬液，将400 μL细胞悬液加入铺有Matrigel（BD公司）的transwell小室上室，下室中加入800 μL含10%FBS的培养基，37℃、5%CO2的细胞培养箱中培育36 h，拭去未穿膜细胞，以无水甲醇固定并用结晶紫染色，显微镜计数穿膜细胞。

所谓“知止”，既是自觉地节制，是在思维上将自身置身于矛盾双方所形成的平衡的平衡点。 具体表现为一种与自身超然地位相对应的宏观思维以及在此思维指导下的尽可能客观的行事方式。 通过这种思维及行为，使自身的存在成为平衡的中心点，从而把握矛盾的转化点，从而将不利于己的现实或形势导向对自己有利的方面，在保证基础不受损伤或平衡不被颠覆的前提下谋求发展，确保统治者在社会活动或政治活动中转化的主动权，实现长久不衰的统治，也就是“常”。

1.2.4 细胞增殖能力的检测 分别采用MTT法和克隆形成法检测细胞的增殖能力。MTT法如下：以每孔3000个细胞种植96孔板，分别于细胞贴壁 后 0、24、48、72、96、120、144 h 每 孔 加 MTT（5 mg/mL，Sigma）20 μL，37 ℃，5%CO2的潮湿环境中孵育4 h后，每孔加150 μL二甲基亚砜并于570 nm波长处检测吸光度（OD值）。克隆形成法如下：以每孔200个细胞种植6孔板，1周后以无水甲醇固定，结晶紫染色后可在显微镜下观察并计数细胞克隆。

1.2.5 划痕检测细胞的迁移能力 以每孔1×104个细胞种植6孔板，待细胞贴壁后，用白枪头在孔内划痕，PBS洗去漂浮细胞，通过不同时间点观察细胞的划痕距离，分析细胞的迁移能力。

1.3 数据分析 数据均采用SPSS 13.0软件分析，不同实验组间的差异分析通过单因素方差分析或者t检验来完成，计量资料以±s表示，P<0.05时为差异有统计学意义，所有实验均重复3次以上。

当下高速发展的社会经济是一把双刃剑，不仅可以促进供电企业的发展，也可以致使部分企业丧失市场竞争力，如何应对电力需求量不断增加的挑战，确保电力营销抄核收工作的准确性，是企业长期发展的目标。电力营销抄核收工作作为供电流程中的重要环节，企业应该及时针对存在的问题，进行模式改革、创新，正确处理管理模式落后、抄表系统不健全、核收有漏洞等约束企业发展的问题，灵活运用高科技技术和先进设备，提高抄核收系统的自动化和智能化水平，不断健全企业内部的管理体系，提升电力企业的输出质量和运输效率，努力使得供电能力满足逐渐增加的用电需求，完善电力服务工作。

2 结果

1.2.2 重组质粒的构建及慢病毒包装 以BgII和Not I双酶切质粒pEGFP-N3-Anxa2及其突变体，以BamHI和NotI双酶切pCDH载体，胶回收酶切产物并连接过夜，挑取克隆经酶切验证，取阳性克隆送交上海英俊基因测序公司进行测序。将测序成功的重组质粒、慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G和Lipofectamine2000经无血清的培养基稀释后加入293T细胞中，48 h后收集并浓缩含有病毒颗粒的培养液。

对照组患者采用常规脑出血治疗,依据患者影像诊断采用常规治疗,采用醒脑注射液治疗,并且作止血、防感染操作。

图1 野生型Anxa2和第23位酪氨酸突变体表达载体的测序结果Fig 1 The sequencing results of wild type and mutants on Tyrosine 2

1.2.1 目的质粒的构建、扩增及鉴定 以现有质粒pEGFP-N3-Anxa2为模板，采用PCR定点突变技术构建Anxa2第23位酪氨酸突变为丙氨酸和天冬氨酸的质粒：pEGFP-N3-Anxa2Y23A，pEGFP-N3-Anxa2Y23D。根据Anxa2基因序列，设计含有目的突变基因的两对引物，分别是：

图2 重组质粒双酶切前后的琼脂糖凝胶电泳图Fig 2 The agarose gel electrophoretogram of recombinant before and after digested by restriction enzyme

在《国务院关于加快养老服务业若干意见》中阐释了两种医养结合的类型[7]：一种是在医疗机构中引入养老模块,使具有条件的医疗部门增加康复和保健功能,开辟专门的养老专区;另一种是在养老设施中增加医疗服务的功能,使养老设施在原有功能基础上,拓展医的内容,以此满足老年人的医疗需要．

2.4 Anxa2-WT和Anxa2-Y23D的增殖能力显著增强 通过MTT法做出的细胞生长曲线和克隆形成实验统计结果显示，Anxa2-WT和Anxa2-Y23D的增殖能力和克隆形成能力高于MCF-7、control及 Anxa2-Y23A（图 6A、B），但是 Anxa2-WT和Anxa2-Y23D之间并无明显差异。

图5 Anxa2-WT和MCF-7中Anxa2的免疫荧光图（×400）Fig 5 Immunofluorescence analysis of AnxaA2 in Anxa2-WT and MCF-7 cells（×400）

图6 Anxa2-WT和Anxa2-Y23D的增殖能力显著增强Fig 6 Ability of proliferation and invasion of Anxa2-WT andAnxa2-Y23D has been significantly enhanced

2.5 Anxa2-WT和Anxa2-Y23D的迁移及侵袭能力增强 对 MCF-7、control、Anxa2-Y23A、Anxa2-WT和Anxa2-Y23D等5组细胞进行划痕实验，结果显示，Anxa2-WT和Anxa2-Y23D的伤痕愈合时间比MCF-7、control及Anxa2-Y23A的伤痕愈合时间短（图7A）；同样，穿过铺有Matrigel基底膜的Anxa2-WT和 Anxa2-Y23D的细胞数多于 MCF-7、control、Anxa2-Y23A3 组细胞（图 7B、C）。Anxa2-WT和Anxa2-Y23D的迁移及侵袭能力增强。

图7 Anxa2-WT和Anxa2-Y23D的迁移和侵袭能力提高Fig 7 Ability of migration and invasion of Anxa2-WT and Anxa2-Y23D has been significantly enhanced

3 讨论

膜联蛋白Anxa2属于膜联蛋白家族，是一种钙离子依赖的磷脂结合超蛋白，广泛高表达于各类癌组织中，对于促进肿瘤细胞的发生、发展、侵袭及转移能力有重要作用[1-2，7-8]。课题组前期研究已经证实，在乳腺癌细胞系MCF-7/ADR及MDA-MB-231中，转入小干扰RNA降低Anxa2的表达后，细胞的增殖能力、克隆形成能力、迁移和侵袭能力均显著下降，与之相关的一系列调控细胞周期及增殖的蛋白如 cyclin D1、c-Myc、MMP-2、MMP-9 等的表达也相应下降[9-11]。研究者通过对Anxa2第23位酪氨酸突变为丙氨酸和天冬氨酸的突变体的研究发现，第23位酪氨酸的磷酸化对于Anxa2由细胞质向细胞膜的聚集及其调节胰腺癌细胞的侵袭和迁移至关重要[4]，但是其对于Anxa2在乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭中所起作用的报道却寥寥无几。

计及储能运行特性的独立型交直流混合微网优化调度//张志昌,吴健,骆钊,徐近龙,金雪,李鹤健//(19):118

为观察Anxa2及其23位酪氨酸的磷酸化在乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭等中所起作用，通过PCR定点突变技术，将Anxa2第23位酪氨酸分别突变为丙氨酸（Y23A）和天冬氨酸（Y23D）（图 1），然后将野生型Anxa2WT，突变体Anxa2Y23A以及Anxa2Y23D分别转入乳腺癌细胞系MCF-7中，得到Anxa2表达上调，持续处于抑制状态或模拟其持续激活状态的细胞模型，分别是 Anxa2-WT，Anxa2-Y23A和Anxa2-Y23D。以 MCF-7，control（转入空质粒），Anxa2-WT，Anxa2-Y23A和Anxa2-Y23D 5组细胞为模型，通过MTT法（图6A）和克隆形成实验（图6B）检测细胞的增殖能力和克隆形成能力，结果表明Anxa2表达上调以及Anxa2第23位酪氨酸磷酸化能够提高MCF-7细胞的增殖能力。另外划痕实验结果（图7A）和侵袭实验结果（图7B、C）表明Anxa2高表达以及其23位酪氨酸持续磷酸化的细胞其迁移及侵袭能力增强。

已有研究者证明，Anxa2第23位酪氨酸的磷酸化对于胰腺癌细胞的侵袭和迁移至关重要[4]，本实验结果初步发现Anxa2第23位酪氨酸的磷酸化能增强人乳腺癌细胞系MCF-7的增殖及侵袭能力，提高Anxa2的表达水平或者保持Anxa2第23位酪氨酸的磷酸化状态均可增强MCF-7细胞的增殖和侵袭能力。由此推测，Anxa2在乳腺癌细胞MCF-7的增殖、迁移及侵袭中所起的作用可能与其第23位酪氨酸的磷酸化激活有关，有关Anxa2高表达及其23位酪氨酸磷酸化对于Anxa2发挥作用的分子机制我们将进行进一步的研究。

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