α-甘露糖苷贮积症的分子遗传学及其在临床诊断与防治方面的意义

吴晓昀张杰郭奕斌★

•综 述•

α-甘露糖苷贮积症的分子遗传学及其在临床诊断与防治方面的意义

吴晓昀1张杰2郭奕斌1★

MAN2B1基因突变导致α-甘露糖苷酶缺乏或活性降低是引起α-甘露糖苷贮积症的根本内因。对MAN2B1基因、LAMAN酶的结构和功能的研究、基因型与表现型的相关性研究以及诊防治方面的研究近年来都取得了诸多新进展。本文重点围绕这几方面作一综述。

α-甘露糖苷贮积症；MAN2B1基因；α-甘露糖苷酶；溶酶体α-D-甘露糖苷酶；分子遗传学

α-甘露糖苷贮积症（Alpha-Mannosidosis，OMIM 248500）又名溶酶体α-D-甘露糖苷酶（Lysosomal α-mannosidase，LAMAN，EC 3.2.1.24）缺乏症（lysosomal α-D-mannosidase de fi ciency）或α-甘露糖苷酶B缺乏症（α-mannosidase B de fi ciency），是由于MAN2B1基因发生突变导致溶酶体α-甘露糖苷酶MAN2B1（alpha-mannosidase，MAN2B1，EC 3.2.1.24）缺乏或活性降低而引起的一种罕见溶酶体贮积症[1]。本病呈世界性分布，不同种族、不同地区都有病例报道，但发病率很低，挪威报道为1/750 000，澳大利亚报道为1/500 000[1,2]，国内仅有零星报道，至今仍无统计数字。该病是一种以免疫缺陷，面部骨骼畸形，听力障碍和精神发育迟滞、智力低下为特征的常染色体隐性遗传病[3]。根据临床症状轻重的不同，本病早期分为两种类型：一种是肝脏肿大伴随严重感染后较早死亡的重型（一型），另一种是听力丧失，精神发育迟滞可存活到成年的轻型（二型）[4]。目前，比较新的观点认为，该病应分为三种临床类型，即：I型：轻型，无骨骼异常，病情进展非常缓慢，通常在10岁后才被识别；II型：中间型，在10岁左右可看出骨骼异常并缓慢恶化，在20～30岁慢慢发展为进行性的共济失调；III型：重型，出生不久即可看出骨骼异常，病情进展迅速，通常早夭于中枢神经系统功能紊乱或神经性肌病。临床上常见的，大多属于II型[3,5]。为了更好地理解本病诊防治的研究进展，有必要先了解一下MAN2B1基因与LAMAN酶的结构和生化代谢途径。

1 MAN2B1基因和LAMAN酶

人溶酶体MAN2B1基因（OMIM 609458），也称为laman基因或MANB基因[6]，定位于19号染色体（19 p13.2～p13.11）上，横跨21.5 kb基因组DNA（gDNA），含有24个外显子，cDNA含有1个2 964 bp的阅读框。转录起始位点（transcription initiation sites）主要有3个，分别位于起始密码子ATG上游的-309 bp，-196 bp以及-191 bp位。在转录起始位点上游的134 bp序列中，没有特征性的CAAT或TATA序列，但是其5'端区域含有多个富含GC、可与转录因子SP-1，AP-2，ETF结合的位点[6]。将缺失5'端区域的MAN2B1基因导入细菌CAT基因中，发现150 bp的5'端序列可以促使MANB基因在COS-7细胞的表达。Gotoda等[6～7]分析人MANB基因mRNA的5'端区域，发现其转录部位是位于距离起始密码子“ATG”-28 bp和-20 bp的位置。已测出的MAN2B1基因序列目前已超过2000种，主要存在于人、牛、鼠、禽类等生物的溶酶体、内质网、高尔基体、胞浆和其他细胞器中[8～10]。该基因的转录初始产物约为3.5 kb，编码一个由988个或1011个氨基酸组成的前体。编码988个或1011个氨基酸的多肽链，取决于翻译起始位点所在的位置[6,11]。在经过转染的细胞中，α-甘露糖苷酶是由120 kDa的前体修饰形成，其中一部分经过分选后分泌到胞外发挥作用，另外一部分进入溶酶体后加工修饰成多肽“abc”，“d”和“e”[12～13]。三个多肽大小分别为70 kDa，42 kDa和15 kDa。编码988个氨基酸的多肽，前26个氨基酸为潜在的前导序列，成熟多肽的分子量约为111 kDa，具有11个潜在的N-交联糖基化部位。用逆转录病毒介导法导入患者细胞后，该cDNA可表达高活性的α-甘露糖苷酶。此cDNA与已发表的人溶酶体α-甘露糖苷酶cDNA有不同程度的差异，在第2 315位碱基处发生了T＞C转换，可能与控制酶活性有关[14]。通过Northern印迹杂交可知，MAN2B1基因的表达水平在肺、肾脏、胰脏和外周血白细胞中是最高的。而在中枢神经系统（CNS）中，似乎是在胼胝体和脊髓中最高，而在小脑、大脑皮层、额叶和颞叶中表达水平则较低[14]。这种差异的意义目前还不清楚。

由MAN2B1基因（或laman基因）编码的α-甘露糖苷酶（alpha-mannosidase，MAN2B1或LAMAN）多具有糖苷水解酶38、47家族保守序列。若以酶发挥最佳活性的pH条件分，α-甘露糖苷酶可分为酸性、弱酸性和中性三类；若以所在亚细胞器分，则主要分为细胞质的、高尔基体的、溶酶体的、内质网的、细胞膜的五类。但目前多以基因保守序列进行分类，根据该基因保守序列的不同可将此酶分为三类，即“I类”、“II类”和“未分类”[15]。II类α-甘露糖苷酶具有糖苷水解酶38家族保守序列[16]，主要分布于溶酶体、内质网、高尔基体和胞质等，参与糖蛋白的合成和降解[17～19]，此类α-甘露糖苷酶包括MAN2B1、MAN2B2两种。其中，MAN2B1（也称LAMAN）是人溶酶体酸性α-甘露糖苷酶中最常见的。此酶的异常除了引起α-甘露糖苷贮积症外，还会引起先天性红细胞生成异常性贫血II型等[20]。

2 生化代谢途径

α-甘露糖苷酶主要参与蛋白质糖基化的修饰和糖蛋白聚糖水解的修饰。糖基化和糖蛋白聚糖水解与新生糖蛋白的折叠、成熟、运输、构象维持、半衰期和生物活性关系密切，可对细胞的黏附作用、炎症反应、激素活性、关节炎、免疫监视和癌细胞转移等发挥作用[21]。当MAN2B1出现异常时，低聚糖代谢出现功能紊乱，糖蛋白水解无法进行，导致低聚糖蓄积于溶酶体中，病理组织学变化主要表现为细胞出现广泛空泡变性，临床表现为神经、骨骼发育不全，面部粗糙、听力障碍、反复感染、肝脾肿大等症状。若患先天性溶酶体α-甘露糖苷酶功能障碍，就会引起婴儿踝骨畸形、发育迟缓、运动失调、智力障碍，甚至死亡。本病一般无法治愈[5]。MAN2B1是糖蛋白降解途径的主要外切糖苷酶，参与寡聚糖N端的降解，可以切开高甘露糖和混合型低聚糖中的α（1→2），α（1→3）和α（1→6）糖苷键。对患者尿液糖蛋白降解成分的分析结果显示，主要的溶酶体贮积物是低聚糖Man（α1→3）Man（β1→4）GlcNac，Man（α1→2）Man（α1→3）Man（β1→4）GlcNac和Man（α1→ 2）Man（α1→2）Man（α1→3）Man（β1→4）GlcNac[5]。另外一些含量较少的尿低聚糖在还原端还有N-乙酰葡糖胺。在人体正常代谢过程中，糖蛋白在溶酶体中会被蛋白酶和糖苷酶逐步消化、分解成小分子成份，然后分泌、运送到胞质中以被重新利用。MAN2B1缺乏会导致各器官、系统中未消化的物质如寡聚糖特别是富含甘露糖的寡糖贮积在细胞的溶酶体中，引起溶酶体膨胀，继而造成细胞严重的功能损害，使机体发生广泛的病理变化。然而，溶酶体贮积症的病理生理学机制十分复杂，存储物质的累积并不能完全解释疾病的发生。

3 诊断研究进展

对本病的诊断，早期主要通过外周血检查和尿液中的低聚糖测定做出诊断。前者主要是通过光学显微镜和透射电子显微镜（TEM）来观察重型患者骨髓涂片和外周血淋巴细胞中是否有空泡，从而做出诊断[22]。后者是通过检测尿中富含甘露糖的低聚糖分泌是否增多，可以由薄层色谱法和高效液相色谱法证实，但此法仅可作为辅助诊断[1]。近年来主要是通过酶活性测定和基因突变检测的分子诊断方法进行快速确诊。

3.1 酸性α-甘露糖苷酶活性测定

α-甘露糖苷贮积症最有效、最可靠的诊断方法之一是测定酸性α-甘露糖苷酶（LAMAN）在白细胞、纤维母细胞或其他有核细胞中的活性。这种荧光测定是以4-甲基伞形酮基-α-D-吡喃甘露糖苷为底物，在低pH值（通常在pH4）环境中进行。在患者外周血白细胞中LAMAN活性是正常的5%～15%。残留酶活性可能为来自其他细胞器如高尔基体或胞质的甘露糖苷酶活性。由抗LAMAN多克隆抗体的免疫沉淀反应可知患者LAMAN的活性范围是从正常的0.1%到1.3%[23]。采集胎儿的绒毛细胞或羊水细胞，检测胚胎细胞中的α-甘露糖苷酶活性，可以产前诊断患病胎儿。携带者的LAMAN酶活性可能同正常对照组有重叠，因此对携带者的检测不可靠，需要采用下述的基因检测。

3.2 基因检测

基因突变检测目前都是采用基于PCR的各种检测方法。最常用的是，扩增MAN2B1基因的24个外显子，然后对扩增产物进行直接测序，对所发现的新突变再进行功能学鉴定，这样即可检测DNA的致病突变[24]。父母的携带者分析必须在怀孕之前进行，方可用于后续的产前基因诊断。目前，对MAN2B1基因进行突变分析，已经成为确诊α-甘露糖苷贮积症的又一种最有效的方法。我室近年来在诊断一家α-甘露糖苷贮积症时就是采用了这一方法并成功鉴定了两种致病性突变。

3.2.1 基因突变类型

如上所述，α-甘露糖苷贮积症是由编码溶酶体α-甘露糖苷酶的MAN2B1基因发生突变所致。2011年12月，挪威学者里瑟·斯特兰德报道了其在北欧30个国家的130例甘露糖苷贮积症病人中发现的83种新突变并且做了鉴定及病理分析，确定了其中80种突变为该病的致病性突变[3]。截至本文投稿之日（2013年1月14日）为止，HGMD突变数据库收录的和文献报道的α-甘露糖苷贮积症的致病突变类型已达126种（见表1），包括70种错义/无义突变，18种拼接位点突变，18种小缺失、16种小插入，4种大片段丢失（http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/all.php）。在所查患者中，除少数几个日本裔患者和阿拉伯裔患者外，其他均为欧洲裔[6,7,11,25～28]。且大多为II型，I型只占少数，III型更为罕见。

表1 α-甘露糖苷贮积症的致病突变类型Table 1 Pathogenic mutation types of alpha-mannosidosis

在已报道的致病性突变中，大多数都是独立存在的，即多数突变只发生在不同患者身上或少数几个家庭中[我室近年来在对本病的基因诊断过程中，也查到了一些罕见的突变类型，其中有国外已报道的，也有新发现的突变（待发表），也证实了这一点]。但其中有一个错义突变[c.2248C＞T，导致“精氨酸”（R）替换成“色氨酸”（W），即发生p.R750W错义突变]出现频率甚高，此突变曾于来自50多个不同国家的118例病人中出现，在来自欧洲不同国家的13个病人身上也都有发现。经过研究统计，此位点发生的频率大约为27.5%[1]，占所有来自欧洲患者所检测到的突变类型的30%以上，这一位点很可能为突变热点。基于此位点在人群中具有较高的突变频率，先后有多国学者对存在此突变位点的病人进行了单体型分析。北挪威的学者里瑟·斯坦斯兰德对来自于16个国家的50例在此位点存在错义突变的病人做了同源性分析。选择5个单核苷酸多态性（SNP）位点作为标签进行单体型分析，结果显示：芬兰、波兰和意大利纯合子患者都具有同一种单体型[3]。这些结果显示：p.R750W等位基因的高频率和广泛地理分布可能与始祖效应和复发突变事件有关。

3.2.2 突变检测技术

早期主要采用先经SSCP筛检，然后对可疑标本再用测序进行验证。随着测序成本的降低，现多采用PCR扩增后直接测序技术，既快速又实惠。但对发现的新突变，就需采用一系列方法对突变的致病性进行鉴定。这些方法涉及DNA，RNA和蛋白/酶水平的结构和功能的鉴定。就DNA水平来说，为了排除SNP多态性变异的可能，通常需要对100例以上的正常对照组进行筛检，由于样品量较大，此时可用ARMS法、RE法、DHPLC法等进行快速鉴别鉴定。就RNA水平来说，可采用RT-PCR、cDNA测序法、q-PCR定量鉴定法；而在蛋白/酶水平，可通过Western blotting法、细胞培养、分子克隆和酶活性鉴定等方法。

4 预防研究进展

由于本病属于先天性、遗传性代谢病且至今仍无有效的根治疗法，因此，对本病的最佳应对策略主要重在预防，在孕前、产前、症状出现前做好各种防患措施，包括：产前诊断、选择性流产、携带者检出、遗传优生咨询、再发风险估计、症状前检查等。其中，产前诊断结合选择性流产是目前最为重要和有效的预防手段。

产前诊断的目的主要是预防患胎出生。由于此病胎儿在孕期没有形态结构的改变，产前超声检查无法作出诊断，因此主要是通过产前酶学诊断或/和产前基因诊断。

根据常染色体隐性遗传规律，携带者父母所生的后代每一胎都有25%的患病风险，另有50%为无症状的携带者。产前诊断可在妊娠期10～13周取绒毛，或在15周后抽羊水，分析胎儿细胞中酸性α-甘露糖苷酶的活性或直接进行产前基因诊断。值得一提的是，由于携带者与正常人的酶活性测量值存在交叉，难于鉴别、确诊，故最好是通过突变分析（基因型检测）。一旦查出患胎，在知情同意的基础上尽早终止妊娠。父母的基因型分析严格来讲，都必须在怀孕前进行，除非有意外受孕的特殊情况出现，才可考虑在孕期突击检测，但必须告知各种可能的结果并征得孕妇的知情同意。

5 治疗研究进展

对本病的治疗，早期主要采用对症治疗，但该法只能治标无法治本。随着医学技术的迅猛发展，各种新的疗法已逐步应运而生并逐渐从实验室走向临床。目前正在研究和应用的治疗方式有三种:造血干细胞移植（HSCT），酶替代疗法（ERT）和基因治疗（GT）。其中，HSCT是目前最为可行且有望普及的一种治疗手段，其早期阶段主要是通过骨髓移植。

5.1 造血干细胞移植（HSCT）

对本病患者进行治疗的研究始于1987年。1987年威尔等[29]对一名患者进行了HSCT。然而，成功移植18个星期后竟死于其他并发症。验尸结果显示：移植虽然减少躯体细胞α-甘露糖苷的贮积，但并不能减少脑组织溶酶体内α-甘露糖苷的贮积，因此认为HSCT可能不是一个合适的治疗方法。然而，大脑的零效应可能与来自母亲（携带者）的供体细胞只有50%的活性有关，还与血脑屏障影响HSCT对中枢神经系统的作用有关。1994年史蒂文[30]报道，早期进行HSCT可以阻止一只动物模型猫的神经退化。这可能与HSCT将供体的衍生细胞迁移到患猫的中枢神经系统有关。1998年沃尔等[31]报道了一个HSCT病例，声称在治疗的2年内解决了复发性传染病和器官巨大症以及改善了骨病和神经认知功能。1999年Frostad等[26]报道，一例MANB基因型异常患者在接受正常捐献者的骨髓后存活，并且于一年后检测到该患者的白血球与捐献者完全一致，表明骨髓移植获得了成功，也表明骨髓移植可用于本病的治疗。

随后科研人员又进行了多例HSCT（未发表）。2004年Grewal等[32]报道了四名3岁～23岁患者的结果，声称有三人的智力水平稳定，适应能力和口头记忆功能有所提高。尤其是听力可提高至正常或接近正常水平（语音频率）。2012年又报道了17名1.1岁到23岁的患者的治疗情况，其中有两人移植后5个月内死亡，剩余的15人中，平均随访5.5年，其中有2人发展成严重的急性移植物抗宿主症（≥ II级），6人发展为慢性移植物抗宿主症，3人需要再移植。移植治疗后，患者都有不同程度发育进展且大部分患者的听力都有改善[33]。

有报告表明，移植成功后，躯体特征的矫正通常伴有神经症状不再加重。因此，HSCT带来的益处，必须权衡整个治疗过程相关的发病率和死亡率的风险。并发症出现前，HSCT对年幼患者更有益，而年长患者移植手术的相关并发症则更频繁和严重。因此提倡尽可能早期移植，以减少神经损伤并得到最大化效果。2007年Crawley和Walkley从动物模型得出的数据也支持这一观点[34]。这使得患者早发现、早诊治成为成功的关键。

另外有研究表明，质子核磁共振光谱（MRS）可以检测出与患者脑中糖类分子一致的波峰，是一个监测α-甘露糖苷贮积症治疗效果的有用方法[35]。

5.2 酶替代疗法（ERT）

酶替代疗法（ERT）是溶酶体贮积症如高雪氏症、粘多糖病、庞贝病的一种行之有效的治疗方式。α-甘露糖苷贮积症患者都有MAN2B1基因的缺陷和α-甘露糖苷酶活性的异常。早期的观察表明，产生α-甘露糖苷酶的细胞能够将酶转移到贮积甘露糖苷的细胞中，从而达到治疗的目的。对于α-甘露糖苷贮积症的ERT来说，最早是在1976年，Jolly等首先在动物实验中尝试酶替代疗法，他们利用纯化的牛α-甘露糖苷酶来治疗患病牛，但此实验并没有达到预期的效果。2004年Roces等，2006年Crawley等，在一个人工基因敲除纯合子小鼠模型和一个自然发生突变的豚鼠模型中完成ERT实验[36～38]。这两个模型中几乎所有组织的贮积物都得到明显减少。然而，第一个研究模型发现在大脑中含甘露糖的低聚糖的减少量比患甘露糖苷贮积症的对照小鼠少30%[36]，在豚鼠身上也没有发现脑功能的改善[37～38]。2007年Sedel等，2009年Matzner等，2011年Damme等，2012年Borgwardt等报道，将α-甘露糖苷酶早期植入到患者体内，结果显示此种酶替代疗法对患者的病情有缓慢而持续的效果[39～43]。

5.3 基因治疗（GT）

对于α-甘露糖苷贮积症的基因治疗研究近年来也日益引起重视并有相关报道。目前已建立有编码α-甘露糖苷酶MANB基因缺失的动物模型，包括鼠，猫科动物及荷兰猪等模型[44]。1999年中国学者报道对α-甘露糖苷贮积症患者的基因治疗进行了初步研究。他们将编码人溶酶体α-甘露糖苷酶的cDNA导入病猫皮肤的成纤维细胞。结果显示：人源cDNA在病猫细胞内表达出高活性的α-甘露糖苷酶，重组酶的pH活性范围与正常酶相同。2011年有学者成功将人α-甘露糖苷酶基因转入烟草植物细胞中并获得大量表达，纯化后显示该蛋白与人体中α-甘露糖苷酶有相似的生物学活性[45]，该蛋白有望应用于本病病人的治疗。此外，科学家们还在深入探索基因治疗的可能性。目前，研究人员正致力于该酶基因的分子克隆，已有文献报道，其cDNA序列的克隆已获初步成功，这将为此病患者带来福音。相信在不久的将来，基因治疗的难关一定会被攻克！

6 展望

近年来关于通过调节LAMAN酶实现肿瘤治疗也有文献报道，这为人类战胜肿瘤提供新的研究方向。LAMAN活性受苦马豆素（swainsonine，SW）抑制，但抑制程度不同，其部分受dMNJ抑制。随着苦马豆素对LAMAN抑制作用机制的揭示，研究人员已成功利用苦马豆素诱导建立了牛和小鼠α-甘露糖苷贮积症模型，从而为进一步探索α-甘露糖苷贮积症的机制和治疗方法提供了新的途径。

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Molecular genetics diagnosis of alpha-mannosidosis and its significance in clinical diagnosis and prevention

WU Xiaoyun1, ZHANG Jie2, GUO Yibin1★
(1.Department of Medical Genetics, Sun Yat-sen Medical School, Sun Yat-sen University, Guangdong, Guangzhou 510080, China; 2.Clinical Medicine (Eight Year Program), Grade 2009, Zhongshan School of Medicine, Sun Yat-sen University, Guangdong, Guangzhou 510080, China)

The basic cause of alpha-mannosidosis is the de fi ciency of alpha-mannosidase resulting from theMAN2B1gene mutation. In resent years, there are plenty of research progress with the study of the structure and function ofMAN2B1gene and LAMAN enzyme, the relationship between the genotype and phenotype, and prevention and treatment. This paper focus on these aspects to make a summary.

Alpha-mannosidosis;MAN2B1gene; Alpha-mannosidase(MAN2B1); Lysosomal alpha-D-mannosidase(LAMAN); Molecular genetics

国家自然科学基金（No.30772069）；闽粤横向课题基金（No.7101025）

1.中山大学中山医学院医学遗传学教研室，广东，广州 510080

2.中山大学中山医学院临床专业2009级八年制直博生，广东，广州 510080吴晓昀和张杰为并列第一作者

★通讯作者：郭奕斌，E-mail: guoyibin@mail.sysu.edu.cn和zpgyp@aliyun.com