癌前食管与食管鳞状细胞癌表达CD44及CD44v6的差异

郑淑妍 杨惠钿 陈强 苏少雪 林敏 刘俊斌 杨立业

•论 著•

癌前食管与食管鳞状细胞癌表达CD44及CD44v6的差异

郑淑妍 杨惠钿 陈强 苏少雪 林敏 刘俊斌 杨立业★

目的通过免疫组化研究CD44及CD44v6在癌前食管及食管鳞状细胞癌中的表达情况，探讨其与食管鳞状细胞癌的关系及临床意义。方法收集潮州市中心医院病理科存档的食管病例蜡块（所有病例术前均未接受放、化疗）。采用免疫组化PV-9000二步法（非生物素）检测癌前食管63例，食管鳞状细胞癌140例。SPSS16.0统计软件分析实验结果。对于各组之间表达情况的数据统计采用多独立样本非参数检验：Kruskal-Wallis H检验；各组中两两比较采用两独立样本非参数检验：Kruskal-Wallis H检验的方法进行比较。结果CD44及CD44v6在正常的鳞状上皮，只表达于上皮基底层3～5层细胞，随着上皮的增生，表达的细胞层数逐渐增加，在非典型增生的上皮则主要表达于有异型的上皮，而原位癌则几乎表达于上皮的全层。CD44及CD44v6在各种食管癌前病变组织与食管鳞状细胞癌中的表达均存在差异（均P＜0.01），其中从正常食管组织及伴上皮增生但无细胞异型的食管组织至食管鳞状细胞癌之间，其表达强度逐渐增强，而从非典型增生及原位癌至食管鳞状细胞癌之间的表达强度逐渐减弱。结论CD44及CD44v6在癌前食管及食管鳞状细胞癌中的表达差异，提示它们可能与食管鳞状细胞癌的发生及发展有关，为食管癌干细胞的进一步研究提供线索。

CD44；CD44v6；免疫组化；食管鳞状细胞癌

在潮汕地区，食管癌高发现象不容忽视，其中，又以汕头南澳县最高，其标化发病率在109/10万，其次是揭阳和潮州的饶平地区[1]。如果能够找出其发病原因，也就意味着能够在疾病的预防和治疗上争得先机。CD44分子是由单一基因编码的具有高度异质性的单链细胞膜表面糖蛋白家族，介导细胞与细胞及细胞外基质的粘附作用，从而发挥广泛生物学功能[2]。CD44v6属于变异型CD44（CD44v）家族成员，其过度表达使肿瘤细胞具有转移潜能[3]。我们曾经有实验证实胚胎食管粘膜上皮的基底层均有CD44及CD44v6的表达[4]，而基底层恰恰是上皮的生发层，因此我们设想CD44及CD44v6可能是食管癌干细胞的标志物。本实验针对我院收集的食管癌前组织及食管鳞状细胞癌病理标本及临床资料，采用免疫组织化学的方法检测CD44及CD44v6的表达情况，旨在了解其与食管鳞状细胞癌发生、发展的关系，进一步探索食管鳞状细胞癌的发病机制，为该病的预防与临床治疗提供有价值的信息。

1 材料和方法

1.1 材料

收集我院病理科2003～2006年间收检的术前均未接受过放、化疗的食管手术切除标本存档蜡块，其中正常食管鳞状上皮23例，伴鳞状上皮增生19例，鳞状上皮不同程度非典型增生10例，原位癌11例，鳞状细胞癌140例。

1.2 方法

1.2.1 石蜡切片

将收集蜡块常规石蜡切片3张，裱于已经过APES的硅化玻片上，其中1张用于HE染色，其它2张用于免疫组化染色。

1.2.2 免疫组织化学染色

采用PV-9000二步法（非生物素）进行免疫组化染色。CD44用淋巴结作阳性对照；CD44v6用扁桃体作阳性对照；两者均用PBS代替一抗作阴性对照（对照片均由试剂公司提供），DAB显色，苏木素复染，光镜观察。

1.2.3 结果判断

CD44定位于细胞膜及浆，CD44v6阳性定位于细胞膜，呈显著棕黄色为阳性，根据染色强度及阳性细胞数量分为：“-”、“+”、“++”、“+++”。细胞不着色为0分；浅黄色为1分；黄色为2分；棕褐色为3分。阳性细胞数＜5%为0分；阳性细胞数6%～25%为1分；阳性细胞数26%～50%为2分；阳性细胞数51%～75%为3分；阳性细胞数＞75%为4分。然后着色强度的得分加上着色细胞数的得分为总分，总分0～1为“-”、2～3为“+”、4～5为“++”、6～7为“+++”。

1.2.4 统计学分析

采用SPSS16.0软件，对于各组之间表达强度的数据统计采用多独立样本非参数检验：Kruskal-Wallis H检验；各组中两两比较采用两独立样本非参数检验：Kruskal-Wallis H检验的方法进行比较。

2 结果

CD44及CD44v6在癌前食管及食管鳞状细胞癌中的表达情况具体见表1。在正常的鳞状上皮，只表达于上皮基底层3～5层细胞，随着上皮的增生表达的细胞层数逐渐增加，非典型增生的鳞状上皮则主要在具异型性的上皮细胞中有表达，而原位癌则表达于上皮全层。CD44及CD44v6在食管鳞状细胞癌与各种癌前食管组织之间的表达均存在差异（均P＜0.01），两者在鳞状细胞癌中的表达均强于正常及增生上皮的表达，呈递减趋势；而与非典型增生及原位癌比较，两者的表达均呈递减趋势（图1及图2）。

表1 CD44及CD44v6在癌前食管及鳞状细胞癌中的表达情况Table 1 The expression of CD44 and CD44v6 in different types of esophageal epithelium and squamous cell carcinoma

图1 癌前食管组织CD44的表达情况×100Figure 1 The expression of CD44 in different types of esophageal epithelium×100

图2 癌前食管组织CD44v6的表达情况×100Figure 2 The expression of CD44v6 in different types of esophageal epithelium×100

3 讨论

黏附分子CD44是细胞膜表面跨膜糖蛋白，它作为透明质酸的受体，能与透明质酸等多种配体结合，参与细胞-细胞，细胞-基质之间的特异性黏附。由于翻译后修饰，CD44具有不同亚型：标准型（CD44s）和变异型（CD44v）两大类。人类CD44基因位于11号染色体短臂上，有20个外显子，分为组成型外显子和变异型外显子。其中第6～15外显子为变异型外显子，即v区外显子（v1～v10），能以变异方式拼接。含有变异型外显子插入的CD44转录子统称为变异型CD44（variance form CD44，CD44v），主要在上皮源性细胞和肿瘤细胞中表达[5]。大量的研究表明CD44的表达情况与恶性肿瘤的发生、发展关系密切，有关CD44促进肿瘤侵袭和转移越来越受到重视。有报道认为肾细胞癌[6]中CD44阳性表达的癌细胞比阴性的细胞具有更强的侵袭转移能力，说明CD44在肿瘤侵袭和转移方面发挥重要的作用，这也是近年来提出的比较新的课题，其研究还处于早期阶段，目前大部分研究倾向于把CD44基因作为一种干细胞标记物。CD44v6是含v6变异体的CD44拼接变异体，它通过与透明质酸结合，影响肿瘤细胞之间以及肿瘤细胞与基质的结合能力，增强肿瘤细胞的运动能力，促进肿瘤细胞的浸润和转移，为目前比较公认的肿瘤转移促进基因。它多见于有转移能力的肿瘤细胞，而正常细胞和相同组织来源的非转移性肿瘤细胞表达较少，CD44v6的表达可改变肿瘤细胞表面黏附分子的构成和功能，有助于肿瘤细胞获得转移潜能。有报道认为CD44v6的过表达与肺癌的浸润与转移有关[7]。

在本组正常食管鳞状上皮中，CD44及CD44v6大部分表达于上皮基底层的3～5层细胞，而随着上皮的增生、非典型增生到原位癌的演进过程，其表达的细胞层数逐渐增多，呈现颇具规律的变化，这与文献[8]报道一致。在原位癌中，CD44及CD44v6几乎表达于上皮全层细胞。食管鳞状细胞癌的发生发展经历了食管粘膜上皮基底细胞过度增生、非典型增生和原位癌，这些形态学改变是食管鳞状细胞癌高易感人群癌变早期的重要特征[9]，并将这些病变称之为食管的癌前病变[10]。食管癌的早期诊断实际上就是及时发现癌前病变或癌前状态患者，尤其是重度非典型增生和原位癌。而CD44及CD44v6在正常鳞状上皮、增生鳞状上皮、非典型鳞状上皮及原位癌中细胞表达层次逐渐增加的规律性变化其演进过程存在一定程度的拟合。所以我们认为CD44及CD44v6的表达与肿瘤发生的早期可能存在一定的关系，能否作为早期食管癌筛查的一个指标值得我们进一步探讨。同时，从正常及增生上皮到鳞状细胞癌之间CD44及CD44v6的表达呈递增趋势，而从非典型增生及原位癌到鳞状细胞癌则呈递减趋势，这说明了肿瘤的发生、发展是一个复杂的过程，仍需我们继续探索。

[1] Su M, Liu M, Tian D P, et al. Temporal trends of esophageal cancer during 1995-2004 in Nanao Island, an extremely highrisk area in China[J]. Eur J Epidemiol, 2007, 22(1): 43-48.

[2] Naor D, Wallach-Dayan S B, Zahalka M A, et al. Involvement of CD44, a molecule with a thousand faces, in cancer dissemination[J]. Semin Cancer Biol, 2008, 18(4): 260-267.

[3] Orian-Rousseau V. CD44, a therapeutic target for metastasising tumours[J]. Eur J Cancer, 2010, 46(7): 1271-1277.

[4] 郑淑妍, 陈强, 黄小萍, 等. CD44及CD44v6在胚胎各器官中的表达及意义[J]. 分子诊断与治疗杂志, 2011, 3(3): 166-169.

[5] Sugahara K N, Hirata T, Hayasaka H, et al. Tumor cells enhance their own CD44 cleavage and motility by generating hyaluronan fragments[J]. J Biol Chem, 2006, 281(9): 5861-5868.

[6] Lim S D, Young A N, Paner G P, et al. Prognostic role of CD44 cell adhesion molecule expression in primary and metastatic renal cell carcinoma: a clinicopathologic study of 125 cases[J]. Virchows Arch, 2008, 452(1): 49-55.

[7] Situ D, Long H, Lin P, et al. Expression and prognostic relevance of CD44v6 in stage I non-small cell lung carcinoma[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2010, 136(8): 1213-1219.

[8] Roye G D, Myers R B, Brown D, et al. CD44 expression in dysplastic epithelium and squamous-cell carcinoma of the esophagus[J]. Int J Cancer, 1996, 69(4): 254-258.

[9] Wang L D, Qin Y R, Fan Z M, et al. Comparative genomic hybridization: comparison between esophageal squamous cell carcinoma and gastric cardia adenocarcinoma from a high-incidence area for both cancers in Henan, northern China[J]. Dis Esophagus, 2006, 19(6): 459-467.

[10] Wang L D, Lipkin M, Qui S L, et al. Labeling index and labeling distribution of cells in esophageal epithelium of individuals at increased risk for esophageal cancer in Huixian, China[J]. Cancer Res, 1990, 50(9): 2651-2653.

The difference on expression of CD44 and CD44v6 between esophageal epithelium and squamous cell carcinoma

ZHENG Shuyan, Yang Huitian, CHEN Qiang, SU Shaoxue, LIN Min, LIU Junbin, YANG Liye★
(Department of Pathology, Chaozhou Central Hospital Affiliated to South Medical University, Guangdong, Chaozhou 521000, China)

ObjectiveTo explore the relationship and clinical signi fi cance through investigated the expression of CD44 and CD44v6 in different types of esophageal epithelial hyperplasia and squamous cell carcinoma by immunohistochemical method.MethodsParaf fi n blocks of esophageal carcinoma were collected from department of Pathology, Chaozhou central hospital. The patients were not treated with chemotherapy or radiotherapy before operation. The expression of CD44 and CD44v6 in 63 cases of esophageal epithelial hyperplasia and 140 cases of esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) were detected by immunohistochemistry PV-9000 two-steps methods using monoclonal antibodies. The results were analyzed with SPSS 16.0 statistics software. The difference of expression between each sample in one group was analyzed by multi-independent samples nonparameter tests (Kruskal-Wallis H tests). The difference of expression between two samples in one group was analyzed by 2-independent samples nonparameter tests (Kruskal-Wallis H tests).ResultsIn normal squamous epithelium, only 3～5 layers of cells were positive for CD44 and CD44v6, and the expression of cell layers gradually increased with the epithelial hyperplasia. The atypical hyperplasia epithelium were mainly expressed in atypia epithelial, and almost all epithelial layers expressed in carcinoma in situ. There were signi fi cant difference for the expression of CD44 and CD44v6 between normal squamous epithelium and ESCC, the hyperplasia epithelium and ESCC, the atypical hyperplasia epithelium and ESCC, the carcinoma insitu and ESCC (allP＜0.01). The expression of CD44 and CD44v6 in ESCC was greater than normal squamous epithelium and hyperplasia epithelium, but it was weaker than atypical hyperplasia epithelium and carcinoma in situ.ConclusionThe different expression of CD44 and CD44v6 in different types of esophageal epithelium and ESCC implied that CD44 and CD44v6 may be relate to the occurrence and development of ESCC. They may be the stem cells of ESCC.

CD44; CD44v6; immunohistochemistry; Esophageal squamous cell carcinoma

广东省医学科学技术研究基金（B2008179）；广东省社会发展计划（2011B031800329）

南方医科大学附属潮州市中心医院病理科，广东，潮州 521000

★通讯作者：杨立业，E-mail: yangleeyee@sina.com