开口箭甲醇提取物抗氧化和抑菌活性研究

石宛平，张怡轩，林奇泗，2，王淼，王慧，赵春杰，*

（1.沈阳药科大学药学院，辽宁 沈阳 110016；2.徐州医学院药学院，江苏 徐州 221004）

中药开口箭别名牛尾七、岩七，为百合科铃兰族开口箭属植物开口箭Tupistra chinensis Bak.，以根状茎入药[1]。夏秋二季采挖，除去须根，洗净，晒干。主要分布于湖北、江西、福建、安徽、河南、陕西、四川、云南、广西，生于林下阴湿处，溪边和路旁，海拔1 000 m～2 000 m[2]。其味甘，微苦。有毒。具有清热解毒，散瘀止痛。用于白喉，风湿关节痛，腰腿疼，跌打损伤，毒蛇咬伤；外用治痈疖肿毒[3]。

开口箭的醇提物对咽喉部常见致病菌如金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌等有较好的体外抑菌作用[4]。本文采用圆盘扩散法比较了开口箭醇提取物的对2 种细菌和2 种真菌的抑制活性。至2013 年1 月1日为止，鲜见对开口箭提取物的抗氧化活性研究报道。抗氧化活性的机制较为复杂，应采用一种以上方法对药物的抗氧化研究[5]。本文对开口箭醇提取物进行抗氧化活性的研究，并比较开口箭醇提取物中石油醚层、氯仿层、乙酸乙酯层和正丁醇层的抗氧化活性，为进一步探讨开口箭药理作用打下基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器与设备

HH-2 数显恒温水浴锅：浙江省嘉兴市俊思仪器设备厂；HH-3 数显恒温油浴锅：江苏金坛市江南仪器厂；SC-97 自动三重纯水蒸馏器：上海亚荣生化仪器厂；BS110 电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；UV-1700 型可见-紫外分光光度计：日本SHIMADZU公司。

1.2 实验材料

1.2.1 材料与试剂

无水硫酸钠（分析纯）：天津大茂化学试剂厂；实验用水为实验室自制三重蒸馏水；甲醇、乙醇（95%）、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和二甲基亚砜：均为分析纯，山东禹王实业有限公司；2，4，6-反式2-吡啶基三嗪（TPTZ）、维生素C（VC）：上海阿拉丁试剂有限公司；开口箭药材：鹏翔药业，批号90021，经沈阳药科大学中药学院贾景明教授鉴定，为百合科开口箭属植物开口箭Tupistra chinensis Bak.的根状茎，将开口箭药材粉碎，过二目筛，贮于干燥器中备用。

1.2.2 供试菌种

大肠埃希氏菌（ATCC8739）、金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、白色念珠菌（ATCC26970）和新型隐球菌（ATCC9763）：由沈阳药科大学生命科学与生物制药学院提供。细菌菌株在37 ℃下Luria-Bertani（LB）培养琼脂中培养24 h，真菌在30 ℃下马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）中培养72 h。

2 方法

2.1 开口箭提取物制备

2.1.1 开口箭甲醇提取物制备

取开口箭粉末约10 g，加入甲醇150 mL 索氏提取6 h。提取液滤过后用旋转蒸发仪（温度50 ℃）浓缩干燥，得深棕色浸膏备用。

2.1.2 开口箭不同萃取溶液制备

取根据2.1.1 制得的开口箭浸膏，加入100 mL 蒸馏水溶解，分别依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃取3 次。合并石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取液，并浓缩至干，放至冰箱冷藏备用。

2.1.3 TPTZ 工作液的配制

将2.5 mL 20 mmol/L FeCl3·6H2O，2.5 mL 10 mmol/L TPTZ（以40 mmol/L 盐酸溶解），25 mL 0.3 mmol/L 的醋酸缓冲液（pH3.6），临用前混合。

2.2 开口箭抑菌活性研究

2.2.1 抑菌活性研究

通过圆盘扩散法[6]进行开口箭抑菌活性研究，将由2.1 制得的开口箭的醇提浸膏溶解在2%的二甲基亚砜中制成最终浓度为40 mg/mL 的溶液，通过0.2 μm的微孔滤膜过滤，灭菌备用。将含有细菌108 CFU/mL和真菌106 spore/mL～107 spore/mL 的灭菌生理盐水300 μL 分别均匀涂在Luria-Bertan（iLB）培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上。将30 μL 的开口箭醇提取液和2%的DMSO（作为阴性对照）浸渍在直径6 mm 的滤纸片上，将浸渍好的滤纸片放在被接种的琼脂上。接种细菌菌株的培养皿在37 ℃下培养24 h，接种真菌菌株的培养皿在30 ℃下培养72 h。用抑制区的直径来衡量抗菌活性的大小。每个试验重复两次。

2.2.2 最低抑菌浓度（MIC）的测定[7]

将开口箭的醇提取物溶解在2%的DMSO 中，用二倍稀释法稀释并添加到各种供试菌的菌悬液。对于真菌实验，培养皿在30 ℃培养72 h；对于细菌实验，培养皿在37 ℃培养24 h。以没有肉眼可见的细菌或真菌生长时的最低浓度为最小抑菌浓度（MIC）。

2.3 抗氧化活性研究

2.3.1 对DPPH 自由基的清除作用[8]

将由2.1.1 制得的开口箭醇提物及由2.1.2 制得的4 种溶剂萃取物用95 %乙醇溶解并配制为一系列不同浓度受试样品乙醇液。分别取2.0mL 待测液与2.0mL 0.2 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液混合，振摇均匀后放于暗处静置30 min，于518 nm 处测定吸光度（A）i。同时测定2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH 溶液与2.0 mL 95%乙醇混合液的吸光度（A）j，以及2.0 mL 待测液与2.0 mL 95%乙醇混合液的吸光度（AC），加样情况见表1。

表1 DPPH 试验反应液试剂组成与体积Table 1 Compositions and volumes of DPPH assay

按式（1）计算清除率，每样测定3 次并取平均值。以维生素C 水溶液的标准溶液为阳性对照。再根据不同浓度样品的清除率作曲线求出半清除率（EC50）。

2.3.2 FRAP 法测定总抗氧化能力[9]

FeSO4标准曲线的制作：分别取不同质量浓度的FeSO4溶液50 μL，各加入3.0 mL 2.1.3 项下配制的TPTZ 工作液，37 ℃水浴30 min，测定597 nm 处的吸光度。以吸光度为纵坐标，FeSO4质量浓度为横坐标绘制标准曲线。

样品总抗氧化能力的测定：准确吸取样品溶液50 μL，加入3.0 mL TPTZ 工作液，37 ℃水浴30 min，测定597 nm 处的吸光度。

3 结果与讨论

3.1 开口箭甲醇提取物对4 种病原菌的抑菌活性

开口箭甲醇提取物对四种病原菌的抑菌圈大小及最小抑菌浓度见表2。

表2 开口箭甲醇提取物的抗菌活性Table 2 Antimicrobial activity of the methanol extracts from Tupistra chinensis

由表2 可知，开口箭甲醇提取物对细菌（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）的抑制效果明显，尤其对金黄色葡萄球菌的抑制作用最好，但对真菌（白色念珠菌和新型隐球菌）的抑制作用不明显。

3.2 开口箭提取物抗氧化活性测定

3.2.1 对DPPH 自由基的清除作用

不同极性溶剂萃取开口箭萃取得率存在较大的区别，结果见表3。

表3 四种溶剂萃取结果Table 3 Yields of four fractions of Tupistra chinensis

分别测出开口箭一系列不同浓度甲醇提取物吸光度Ai，Aj，AC，根据公式（1）计算出其相应的自由基清除率。本研究以维生素C（VC）为对照，测定开口箭甲醇提取物的浓度-清除率曲线，浓度以mg（生药量）/mL计算，结果见图1。

图1 开口箭甲醇提取物DPPH 清除率测定结果Fig.1 DPPH radical scavenging activities of the methanol extract from Tupistra chinensis

从图1 可看出，自由基清除率随着加入量的增加而增加，但随着抗氧剂浓度的增加，其捕获的DPPH 自由基也越多，逐渐达到饱和状态，变化也逐渐趋于缓慢。开口箭甲醇提取物的抗氧化活性略强于维生素C。

半清除率指清除率为50%时所需样品的浓度，所需浓度越低，表明半清除率越高。根据不同浓度样品的清除率作曲线求出半清除率（EC50），浓度以mg 生药量/mL 计算。本实验比较了开口箭石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的半清除率（EC50），结果见图2。

图2 开口箭四种萃取物半清除率比较Fig.2 EC50s of the 4 fractions of Tupistra chinensis

由图2 可知，开口箭醇提取物对DPPH 自由基有良好的清除作用。开口箭醇提取物各层对DPPH 自由基的清除能力次序为：开口箭石油醚层<开口箭乙酸乙酯层<开口箭氯仿层<开口箭正丁醇层。

3.2.2 FRAP 法测定总抗氧化能力

实验确定了以FeSO4为对照品的总还原能力标准曲线方程y=0.195x+0.003（r=0.999 2）。由此得出开口箭甲醇提取物的FRAP 值为（0.196±0.007）mmol/g。而开口箭石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取物的FRAP 平均值分别为1.85×10-3、1.38×10-2、1.30×10-2和1.46×10-2mmol/g，结果见图3。

图3 开口箭四种萃取物FRAP 值Fig.3 FRAP value of the 4 fractions of Tupistra chinensis

开口箭醇提取物各层的抗氧化能力次序为：开口箭石油醚层<开口箭乙酸乙酯层<开口箭氯仿层<开口箭正丁醇层。与对DPPH 自由基的清除能力一致。

4 结论

本研究表明开口箭甲醇提取物具有一定的抑菌活性。开口箭甲醇提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌这两种细菌的抑制效果明显，但对白色念珠菌和新型隐球菌这两种真菌的抑制作用不明显。开口箭不同溶剂萃取物的抗氧化活性，在一定的浓度范围内都呈现出一定的量效关系，即提取物的浓度越大，抗氧化活性越高。其中石油醚萃取物的抗氧化活性最弱，而氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取物的抗氧化活性较强。开口箭是一种具有广阔开发前景的中药材。据文献报道，开口箭还具有抗炎[10]及抗肿瘤[11]的作用，对开口箭的药品开发和综合利用还有待于进一步研究。

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