龙眼叶黄酮的体外抗氧化活性

周琼花，黎入荧，青增济，吕龙祥，黄锁义

（1.右江民族医学院临床学院，广西百色 533000；2.广西中医药大学药学院，广西南宁 530001；3.右江民族医学院药学系，广西百色 533000）

龙眼叶黄酮的体外抗氧化活性

周琼花1，黎入荧1，青增济1，吕龙祥2，3，黄锁义3，*

（1.右江民族医学院临床学院，广西百色 533000；2.广西中医药大学药学院，广西南宁 530001；3.右江民族医学院药学系，广西百色 533000）

摘 要：对龙眼叶黄酮的抗氧化作用进行研究。以95%乙醇为溶剂，水浴回流提取龙眼叶中的黄酮；采用比色法测定龙眼叶黄酮对DPPH·、O2-·和·OH三种自由基的清除作用以及还原能力。龙眼叶黄酮对三种自由基都有明显的清除作用，清除能力为DPPH·＞·OH＞O2-·；对Fe3+也具有较强的还原能力。清除率与浓度存在明显的量效关系，当黄酮浓度为0.07mg/L时，其清除率O2-·为16.5%，DPPH·为58.8%，·OH为52.5%；还原Fe3+能力随黄酮的浓度增加而增强。

关键词：龙眼叶；黄酮；抗氧化

黄酮类（flavontes）化合物是植物光合作用产生的一大类化合物，其药用价值很高，具有抗癌、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、免疫调节、降血糖、治疗骨质疏松、抑制抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射等作用[1-2]。现代研究表明[3]，由于氧化损伤的机制在疾病的发生发展中起着重要的作用，因此，重要的抗氧化作用是使其达到治疗效果的重要因素。很多疾病包括肿瘤、心脑血管疾病、老年痴呆等都不同程度地与自由基损害有关。而黄酮类化合物是自然界中抗氧化作用最强的一类天然化合物，由于它具有很强的抑制活性氧、清除自由基作用，同时毒副作用相对小于化学合成药，在食品中它们应用于功能性食品添加剂和功能食品。因此，黄酮类化合物一直是人们致力于寻找新药的重要研究领域。

龙眼（Dimocarpus longan Lour）为无患子科龙眼属常绿果树，乔木。龙眼的果实俗名桂圆，又名龙目、比目、荔枝奴、益智、亚荔枝、圆眼、川弹子、骊珠、燕卵、蜜脾、鲛泪、木弹、秀木团等[4]，为我国著名的亚热带水果。龙眼原产于我国南部和越南北部的南亚热带区域，在我国已有2000多年栽培历史，是重要的南亚热带常绿长寿果树，为四大岭南佳果之一。其主要化学成分为葡萄糖苷、谷甾醇、豆甾醇等，我国福建、广东、广西及台湾等省区为主要生产区，海南、云南、四川和贵州等省也有种植[6]。

李时珍在《本草纲目》中说：“食品以荔枝为贵，而资益以龙眼为良。”龙眼的营养价值很高，是南方著名佳果之一。龙眼还是重要的药材，苏颂撰写的《图经本草》，说龙眼“甘平无毒，主治五脏邪气，安志压食，久服强魄聪明，轻身不老，通神明”。李时珍的《本草纲目》也说龙眼有“开胃健脾，补虚益智”的功效。龙眼肉可以治疗虚劳羸弱，失眠健忘，惊悸怔仲、以及脾虚泄泻，产后浮肿等症。此外，龙眼叶、龙眼壳、龙眼花和龙眼皮、根均可以作为配伍的中药[6]。龙眼叶因为得不到合理的利用，每年都有大量的白白地浪费。龙眼叶中含有大量的生物碱及其他重要成分，对中药事业的研究开发具有重要价值[7]。本文报道龙眼叶总黄酮对DPPH·、O2-·和·OH自由基的清除作用以及还原Fe3+能力。

1 仪器与材料

722N可见分光光度计：上海精科；ZKJ-1002循环水式真空抽气泵：上海嘉鹏科技有限公司；旋转蒸发器RE-52AA：上海安亭实验仪器有限公司；HH-SA数显恒温水浴锅：上海上登实验设备有限公司；DPPH：美国Sigma公司；龙眼叶：采摘于右江民族医学院校内。

2 方法与结果

2.1 总黄酮的提取

取烘干的龙眼叶，粉碎至粉末。称取龙眼叶粉末约6 g加80 mL95%乙醇，水浴回流提取2.5 h，抽滤。滤渣再加80 mL95%乙醇，水浴回流提取2.5 h，抽滤，合并两次滤液减压回收乙醇至滤液仅剩5 mL～7 mL左右为止，放置100 mL容量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度，得样品液。

2.2 黄酮的含量测定

龙眼叶黄酮含量测定[8]：分别精密吸取黄酮提取液0.5 mL于10.00 mL容量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠溶液0.30 mL，摇匀，静置6 min；再加10%硝酸铝溶液0.30 mL，摇匀，静置6 min；再加4%氢氧化钠溶液4.00 mL，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，静置12 min，以试剂空白作参比液，于510 nm处测吸光度A。A=0.635，根据回归方程：A=-14.46C-2.230×10-2，计算样品中总黄酮的含量ρ=0.909 0 mg/mL。

2.3 黄酮提取物清除DPPH自由基能力

DPPH是一种稳定的自由基，与抗氧化剂发生反应，提供H被还原，颜色发生变化，由深紫色变为淡黄色，可以用紫外可见分光度法定量测定。取0.5 mL新配置的 DPPH 溶液[c（DPPH）=6×10-4mol/L]置于 10 mL的具塞比色管中，然后加入不同体积的样品溶液，无水乙醇定容至5 mL，室温暗光下反应30 min，以无水乙醇调零，在517 nm处测定其吸光度A。以高浓度逐渐稀释的方式检测不同浓度样品对自由基的清除率，以自由基清除率为50%时样品的浓度（IC50）来衡量样品对自由基的清除能力。IC50越小，表明样品清除自由基的能力越强。其清除率计算公式：

清除率（%）=[（A1-A2）/A1]×100%

式中：A1为反应时间t=0 min时空白吸光度；A2为反应时间t=30 min时的吸光度。

以试验提取液总黄酮作为样品用无水乙醇定容至5 mL分别测其对DPPH自由基清除的作用结果见图1。

图1 DPPH自由基清除率Fig.1 DPPH free radicals clearance

由图1可以看出，随着黄酮浓度的增加，对DPPH的清除作用增大，自由基清除率为50%时样品的浓度（IC50）为0.052 mg/L，浓度较小，表明龙眼叶黄酮清除DPPH自由基的能力较显著。

2.4 黄酮提取物清除超氧自由基能力

采用邻苯三酚自氧化法进行测定。具体方法如下：取0.5 mol/L、pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.0 mL于干燥具塞比色管中，置于25℃水浴中预热20 min，分别加入不同浓度的待测品0.2 mL，后均加入2.5 mmol/L邻苯三酚（由10 mmol/L HCl制）0.8 mL，混匀后25℃水浴中准确反应4 min，立即加入10 mmol/L HCl 2滴终止反应，蒸馏水调零，在320 nm处测定吸光度A。其清除率计算公式：

式中：A0为加邻苯三酚但不加样品时的吸光度；A1为加样品和邻苯三酚时的吸光度；A2为加样品不加邻苯三酚时的吸光度。

超氧自由基清除率见图2。

从图2中可以看出，龙眼叶总黄酮提取液对O2-·有一定的清除作用，随着龙眼叶总黄酮提取液浓度的增加，对O2-·自由基的清除能力也增强，说明当黄酮类物质的浓度增加时，其清除率也增大。

图2 超氧自由基清除率Fig.2 Clearance rate of superoxide redical

2.5 黄酮提取物清除·OH自由基能力

参照Fenton反应的方法建立反应体系模型[9]，利用H2O2与Fe2+反应产生·OH，由于·OH具有很高的反应活性，存活时间短，若在反应体系中加入水杨酸，就能有效地与·OH结合，产生有色产物。反应是如下：H2O2+Fe2+→ Fe3++·OH+OH-

该产物在510 nm处有强吸收，若在此反应体系中加入具有清除·OH功能的被测物，便会与水杨酸竞争·OH，从而使有色参物生成量减少，采用固定反应时间法，在相同体积的反应体系（8.8 mmol/LH2O21 mL，9 mmol/L Fe2+1 mL，9 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液 1 mL）加入一系列不同浓度的样品溶液，并以蒸馏水为参比，与试剂空白液为比较，在510 nm处测量各浓度下的吸光度，便能测定被测物（总黄酮）对·OH的清除作用，其清除率计算公式：

清除率（%）=[（A0-AΧ）/A0]×100%

本试验以提取液总黄酮作为样品，分别取不同体积的样品定容到10 mL分别测其对·OH的清除作用。结果见图3。

图3 ·OH自由基清除率Fig.3 Clearance rate of·OH radicals

从图3中可看出，随着黄酮浓度的增加，对·OH自由基的清除能力也增强。

2.6 还原Fe3+能力

采用普鲁士兰法测定样品还原Fe3+能力。在系列10 mL具塞比色管中依次加入不同浓度的样品溶液2.5 mL，2.5 mL磷酸盐缓冲液 [C（磷酸盐缓冲液）=0.2 mol/L pH6.6]和2.5 mL铁氰化钾（1%），混匀后置于50℃水浴中反应20 min，然后加入2.5 mL三氯乙酸（10%），混匀后将溶液浑浊离心（3 000 r/min）10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL（0.1%）三氯化铁溶液，混匀，以试剂空白作参比，在700 nm处测定吸光度值，吸光度值增加表明还原能力增强。

表1 还原Fe3+能力吸光度值Table 1 Reduction Fe3+ability absorbency value

由表1可以看出，随着黄酮浓度增大，其吸光度值增加，对Fe3+还原能力增强。

2.7 三种自由基清除率的比较

龙眼叶黄酮对三种自由基都有明显的清除作用，如图4所示。

图4 对DPPH·、O2-·和·OH三种自由基清除率的比较Fig.4 Comparison of DPPH·，O2-·，·OH radicals clearance rate among the three

对自由基的清除能力强弱是：DPPH·＞·OH ＞ O2-·。

3 结论

本研究表明，龙眼叶黄酮对DPPH·、O2-·和·OH三种均具有较好的清除作用，而且对自由基的清除作用随着黄酮液浓度的增加而增强。当黄酮的浓度为0.07 mg/L时，其清除率O2-·为16.5%，DPPH·为58.8%，·OH为52.5%；对金属Fe3+还原能力随黄酮的浓度增加而增强。因此，龙眼叶黄酮具有较强的抗氧化活。

近年来，世界上掀起了植物药开发的热潮，植物药以其天然低毒的特点备受青睐，而黄酮类化合物以其光谱的药理作用引人瞩目。我国龙眼叶资源非常丰富，因此，龙眼叶黄酮所具有的抗氧化活性使其有望作为天然抗氧化剂和功能性产品而得到开发利用，有良好的开发价值和利用前景。同时，为今后对黄酮类化合物的结构修饰和合成、发现先导化合物提供理论依据和重要的参考意义[10]，这必将对新药的产生、新抗氧化剂的开发、应用及研究产生较大的影响。

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Antioxidant Effect of the Flavanone in the Longan Leaves

ZHOU Qiong-hua1，LI Ru-ying1，QING Zeng-ji1， LÜ Long-xiang2，3，HUANG Suo-yi3，*
（1.School of Clinical Medicine，Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000，Guangxi， China；2.Faculty of Pharmacy，Guangxi Traditional Medical University， Nanning 530001， Guangxi， China；3.Department of Pharmacy，Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000， Guangxi， China）

Abstract：Study on the antioxidant of the flavanone in the Longan leaves.The flavonoids were extracted with w（Ethanol） =95%as the solvent from Longan leaves by water bath backflow.It will determine the flagstone's scavenging process acting on DPPH·，·OH and O2-·with the Spectrophotometry， and the reduction of Fe3+ability.Total flavanone from Longan leaves have significant scavenging effect to three kinds of free radicals，the result of scavenging process is that DPPH·＞·OH ＞ O2-·；moreover it also have strong ability of reduction to Fe3+.Clearance and concentration obvious concentration-response relationship.When the content of the total flavanone of Longan leaves was ρ（Flavanone）=0.07 mg/L，the clearance rate of DPPH·，·OH and O2-·was 58.8%，52.5%and 16.5%.Evident reduction energy of the flavanone was increasing by the concentration.

Key words：Longan leaves；flavanone；anti-oxidant activity

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.09.005

周琼花（1991—），女（汉），本科，研究方向：天然产物化学、药物化学。

黄锁义（1964—），男（汉），教授，硕士研究生导师，研究方向：天然产物化学、药物化学、食品卫生、中草药与植物化学。

2012-08-19