酶联免疫法检测进出口肉制品中的莱克多巴胺

柴铭骏，惠洪文，黄晨

（1.天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，天津 300461；2.内蒙古满洲里出入境检验检疫局，内蒙古 满洲里 021008）

莱克多巴胺是一种苯基乙醇胺类药物，属于β-肾上腺素兴奋剂，作为“瘦肉精”的替代品它能改变养分的代谢途径，促进动物肌肉生长，促进动物体蛋白质沉积，特别是骨骼肌中蛋白质的合成，抑制脂肪的合成和积累，从而改善胴体品质，使生长速度加快[1-2]。但是，人类食用了残留有莱克多巴胺的食品动物后，会出现不同程度的中毒现象。我国农业部已在176 号公告《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》中将其列入了禁用清单。在欧盟等国家，莱克多巴胺已被禁止用作饲料添加剂。

目前关于莱克多巴胺的检测，最通用的方法是使用酶联免疫吸附试验（ELISA）对样品进行初筛，再用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）进行确证[3]。ELISA法利用抗原抗体反应原理对目标物进行测定具有快速、灵敏和高通量等特点，且无需昂贵的仪器，是目前检测部门应用的主要方法[4-6]。本文根据试际检测经验和数理统计原理对莱克多巴胺残留快速检测试剂的选用以及运用综合检测技术手段加强进出口检验把关等有关问题进行了探讨。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂

12043 莱克多巴胺试剂盒：R-Biopharm；3K30 离心机：SIGMA；ELX800UV 酶标仪：BIO-TEK；API 4000液相色谱－串联质谱仪：Applied Biosystem；SE812 氮吹仪：Organomation。

乙酸乙酯、乙腈等试剂均为色谱纯。试验中所用的肉、肝脏等样品均为天津口岸进出口的试际样品。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

取3 g 均质后样品于螺纹离心管中，加入8 mL 乙腈和1 mL 乙酸乙酯，漩涡混合器充分混合，振荡30 min（回旋振荡）。离心：10 min/4 000 g/20 ℃～25 ℃，取4 mL上清液（相当于1 g 样品）于新离心管中，在60 ℃条件下蒸干。残留物溶于2mL正己烷（或正庚烷），加入1mL 样品缓冲液，漩涡混合器混合30 s。离心：10 min/4 000g/20℃～25℃，小心收集下层液体，待ELISA 检测。

1.2.2 酶联免疫测定

测定在室温20 ℃～25 ℃条件下操作，测定之前将试剂盒以及所有试剂在室温（20 ℃～25 ℃）下放置1 h～2 h。加入100 μL 稀释后的抗体溶液到微孔底部，在室温（20 ℃～25 ℃）下孵育15 min，倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打（每轮拍打3 次）以保证完全除去孔中的液体。用250 μL 洗涤缓冲液充入孔中，再次倒掉微孔中液体，重复操作2 次。加入20 μL 的标准品或按1.2.1 处理的样品溶液到各自的微孔中。然后加入100 μL 稀释后的酶标记物到微孔底部，小心充分混合，室温（20 ℃～25 ℃）下孵育30 min。倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打（每轮拍打3 次）以保证完全除去孔中的液体。用250 μL 洗涤缓冲液充入孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作两次。加入100 μL 底物/发色试剂到微孔中，小心充分混合并在室温（20 ℃～25 ℃）下暗处孵育15 min。加入100 μL 反应终止液到微孔中。混合好在450 nm 处测量吸光度值。

1.3 结果计算

按下式计算百分吸光度值：

式中：B 为标准溶液或供试样品的平均吸光度值；BO零标准的标准溶液平均吸光度值；以标准品浓度为横坐标，以百分吸光度值为纵坐标绘制半对数曲线。

1.4 阳性确认试验

对于ELISA 阳性的样品（ELISA 测定大于0.5 μg/kg），按照进出口动物源食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法标准SN/T 1924-2011《进出口动物源食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法》的方法进行样品前处理，以液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）进行确证。色谱柱为MG C18柱（100 mm×2.1 mm，5 μm），流动相A 为0.1%的甲酸水溶液，流动相B 为乙腈，梯度洗脱程序为：0 min～7 min，流动相A 由90 %降至25 %，7.01 min，流动相A 升至90%，保持7min。质谱以正离子模式扫描，采用多反应监测（MRM）方式检测，定量离子对为302.3/164.2，定性离子对为302.3/284.3。方法检出限为0.1μg/kg。

2 结果与讨论

2.1 重复性试验

选用不同批号的试剂盒，做10 次标准曲线，每次试验均做平行试验。典型的ELISA 试剂盒的标准曲线见图1。

图1 标准曲线Fig.1 Standard curve

10 次标准曲线的IC50值在0.728 μg/kg～0.934 μg/kg之间，CV 值为5.67%，每次平行标准品间的CV 值在0.3%～7.8%之间，均＜10%。

2.2 回收率和精密度试验

取若干空白猪肝、猪肉样品，分别添加莱克多巴胺标准溶液，添加终浓度为0.5 μg/kg、1.0 μg/kg，每种浓度6 个平行，测定3 批。计算测定含量（平均值）、添加回收率及批内与批间变异系数。见表1 和表2。

表1 猪肉样品准确度和精密度测定结果Table 1 Test results of pork sample accuracy and precision

表2 猪肝样品准确度和精密度测定结果Table 2 Test results of pork liver sample accuracy and precision

测定结果表明猪肉样品添加浓度的回收率81.5 %～92.4%、批内变异系数3.65%～8.43%、批间变异系数分别为10.42%和9.43%；猪肝样品添加浓度的回收率75.6%～86.7%、批内变异系数4.54%～9.87%、批间变异系数分别为7.84%和9.18%。

2.3 确认试验

采用HPLC-MS/MS 方法对阳性样品进行确认，结果见表3。

表3 验证试验结果Table 3 Verification of the test results μg/kg

从表3 可以看出ELISA 法初筛后为阳性的样品，经LC-MS/MS 法测定后，ELISA 结果总是高于LC-MS/MS 法测定结果。推测原因可能为，莱克多巴胺在动物体内的代谢速度较快，动物在停药3 天以后一部分莱克多巴胺就以代谢物的形式存在了，其主要代谢物为莱克多巴胺葡萄糖苷酸；莱克多巴胺葡萄糖苷酸根据代谢位点的不同，分为莱克多巴胺葡萄糖苷酸A、莱克多巴胺葡萄糖苷酸B 和莱克多巴胺葡萄糖苷酸C[7]。文献提供的试验数据表明，莱克多巴胺抗体对莱克多巴胺的代谢物存在交叉反应，尤其对莱克多巴胺葡萄糖苷酸C 的交叉反应性非常高。莱克多巴胺初筛检测中所采用的ELISA 试剂盒生产商提供的数据表明：该抗体对三种不同代谢物的交叉反应率均较高。基于抗体反应的ELISA 初筛检测方法可以检出动物肉产品中的莱克多巴胺原药与代谢物成分，而HPLC-MS/MS只能检测出样品中的莱克多巴胺原药含量，因此目前ELISA 初筛检测法的结果总是高于HPLC-MS/MS 法，且在代谢物未完全排出之前，随着停药期的延长，这种差别愈加显著。

3 结论

本文采用ELISA 法筛选，LC-MS/MS 法进行确证，可以很好的检测进出口肉制品中莱克多巴胺的残留。在实际中由于莱克多巴胺的特殊性，ELISA 方法与仪器法并不能完全符合。为避免漏检的发生，建议采取以下措施：

1）完善液相色谱-串联质谱法，使其能检测莱克多巴胺代谢物。

2）针对进境肉制品中莱克多巴胺用药量较大，检出含量较高的情况，应将其列为重点监控对象。

总之，在进行莱克多巴胺的检测时要注意其检测的特殊性，确保检测结果的正确性，保证执法的公正性。

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