一种病毒感染引起半滑舌鳎腹水症的病理学观察

张正,荣小军,王印庚,王岚,廖梅杰,李彬

(中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东青岛266071)

一种病毒感染引起半滑舌鳎腹水症的病理学观察

张正,荣小军,王印庚,王岚,廖梅杰,李彬

(中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东青岛266071)

利用石蜡切片技术和电镜技术对患有腹水症的半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis Günther主要组织器官进行了组织病理学观察与分析。结果表明:感染腹水症的半滑舌鳎全身主要的组织器官都发生了不同程度的病理变化,其中鳍部皮肤出现血红细胞浸润和淤积;鳃小叶上皮细胞空泡变性,柱状细胞发生炎症;肝胰脏和肾脏都出现了局灶性的组织坏死和溃烂,组织间充满空泡变性的细胞,超微病理观察发现大量病毒粒子;心脏的心肌组织出现固缩和局灶性溃烂;胆囊壁浆膜层结缔组织增生,毛细血管充血;消化道黏膜层和黏膜固有层分离,黏膜固有层成纤维细胞固缩或水样变性,致密层变疏松。根据病理学研究结果初步分析认为,一种未知病毒可能是半滑舌鳎腹水症的主要致病原。

半滑舌鳎;鱼病;腹水;病毒;组织病理

1 材料与方法

1.1 病鱼样品取样

患腹水症的半滑舌鳎病鱼样品取自山东省某半滑舌鳎工厂化养殖厂,患病半滑舌鳎体长为 (20± 5)cm,体质量为 (50±10)g。发病时,病鱼普遍表现为不爱摄食、腹腔明显隆起,日死亡率约为2%。从发病养殖池中挑取外观腹水症状明显的病鱼放入解剖盘中,现场解剖并剪取鳍、鳃、心脏、肝胰脏、脾、肾、胆囊和消化道等组织器官,将各组织的小块 (不超过 0.5 cm3)放入 Davidson's AFA固定液中固定,用于组织病理观察。同时,剪取厚度小于1 mm的各块病鱼组织,放入电镜固定液中固定,用于超微病理观察。

Davidson's AFA固定液配方:体积分数为10%的多聚甲醛溶液20 mL,体积分数为25%的戊二醛溶液10 mL,0.4 mol/L磷酸缓冲液 (pH 7.2)50 mL,4 mol/L NaCl溶液4 mL,1 mol/L CaCl2溶液0.4 mL,蒸馏水15.6 mL,总体积100 mL。

电镜固定液分为固定液和缓冲液两种,固定液配方:体积分数为50%的戊二醛溶液50 mL,NaCl 1.989 g,蒸馏水50 mL,总体积100 mL;缓冲液配方:100 mL溶液中含 NaH2PO45.54 g,NaOH 1.425 g。使用前将固定液和缓冲液按等体积比混合。

1.2 石蜡切片的制备与观察

将用Davidson's AFA固定液浸泡24 h后的组织块放入体积分数为70%的乙醇中,浸泡36 h后制作病理切片。其制作过程经脱水、浸蜡、石蜡包埋、切片、展片、烤片、脱蜡、染色、封片等步骤。其中,在染色步骤中,依据组织特性的不同,设定鳃和鳍组织的苏木精染色时间为5 min,伊红染色时间为50 s;肝胰脏、脾脏、肾脏、胆囊和心脏组织的苏木精染色时间为4 min,伊红染色时间为1 min;消化道的苏木精染色时间为4 min,伊红染色时间为1.5 min。用Nikon ECLIPSE E800光学显微镜对制备好的病理切片进行显微观察,并用Nikon DS-Fi1数字摄像头结合Nikon NIS-Elements图像分析软件进行拍照和测量。

1.3 电子显微镜切片的制备与观察

综上所述，随着媒介融合时代的到来，新闻受众和新闻生产者之间的界限变得越来越模糊，这一现象的存在不仅仅给新闻编辑带来了严峻的挑战，同时也是一种机遇。要想更好地抓住这次机遇和应对这些挑战，要求新闻编辑准确地做好自我定位，不断提升自身素养，努力成为媒体融合时代中合格且优秀的传媒人才。

将放于电镜固定液中的组织块在4℃条件下固定24 h后,用0.1 mol/L的磷酸缓冲液冲洗3次,每次10 min,再用体积分数为1%的锇酸固定1.5 h。用磷酸缓冲液冲洗后置于梯度乙醇中脱水,再用Epon812包埋剂包埋。使用Ultracut-E型超薄切片机 (Reichert-Jung)制作超薄切片,然后置于铜网上以体积分数为2%的醋酸铅和柠檬酸铅双染色。最后用JEM-1200EX型透射电子显微镜观察超微病理变化并拍照。

2 结果

2.1 临床病变特征

腹水症是半滑舌鳎养殖过程中最为常见的疾病之一,临床病变特征明显,在养殖池中容易发现。发病时病鱼通常不摄食,活力下降,游泳无力或漂游。从外观上看,病鱼显著的病变特征是腹腔隆起呈半球状,打开腹腔后可在腹腔内或者消化道中发现大量无色或淡黄色积液,而消化道中充满积液的情况更为多见。病情严重时,消化道由于大量积水而变成半透明状,并且从泄殖孔中凸出。除了非常明显的体腔积水外,病鱼的鳍部也充血发红,并有轻度的糜烂 (图1-A、B)。内脏团各个器官也有不同程度的病理变化,如肝脏充血、胆囊变色、肾脏异常增大等。腹水症可感染不同养殖时期的半滑舌鳎,感染率高,传播迅速,但在临床上常因各个养殖时期鱼体规格的不同而表现出不同的死亡率。临床调查显示,半滑舌鳎仔稚鱼和体长为15 cm以下的苗种感染该病的累积死亡率高达90%以上。

2.2 显微病理变化

通过对组织病理切片进行显微和超微病理观察发现,患腹水症的半滑舌鳎各个组织器官都出现了不同程度且多样化的病理变化,表现出多器官病变的病理特征。

鳍部皮肤健康半滑舌鳎的体表皮肤分为明显的表皮层和真皮层,真皮层又进一步细分为外膜层和疏松层。病鱼鳍部的临床病变特征表现为明显的组织充血现象 (图1-A、B),而显微病理观察发现病鱼鳍部皮肤的表皮层和真皮层组织中都有大量血红细胞浸润 (图1-C),病情严重时浸润的血红细胞形成点状淤积,最终导致皮肤组织中血红细胞大面积淤积 (图1-D)。

鳃患腹水症的半滑舌鳎鳃丝表现为两种比较典型的局灶性病理变化。一种病变是鳃小叶的扁平上皮细胞发生明显的空泡变性,整个细胞呈水泡状,细胞核及细胞间质完全消失 (图1-E);另一种病变是鳃小叶的柱状细胞发生炎症变化,细胞质着色加深,使整个鳃小叶组织膨胀似增生状 (图1 -F)。但鳃小叶原有的羽毛状排列结构并未出现明显破坏,也未见血红细胞淤积等循环系统障碍。

肝胰脏健康半滑舌鳎的胰脏以大小不等的组织块嵌入到肝组织中,形成肝胰脏。肝细胞为近似椭圆的多角形细胞,在苏木精-伊红 (H.E)染色后呈现均质的空泡样结构。胰腺细胞的细胞质表现出较强的嗜酸性,而细胞间结缔组织的H.E染色为深紫色,表现出非常强的嗜碱性。患腹水症病鱼胰脏组织发生固缩并相互解离,腺体间的结缔组织呈现水样变性,组织变得疏松透明。变性的结缔组织间发现大量颗粒状变性细胞,肝组织间出现血红细胞浸润 (图1-G)。而病变严重的肝组织可见局灶性的组织坏死和溃烂,溃烂的组织间充满大量发生空泡变性的肝细胞 (图1-H)。超微病理观察发现,发生空泡变性的肝细胞仅存细胞壁,胞内细胞器已经完全消失,整个细胞呈空泡样的圆环状(图1-I)。而在坏死的肝细胞及肝组织中发现有大量病毒粒子以及病毒包涵体存在 (图1-J)。

脾脏健康半滑舌鳎的脾脏可以明显区分为红脾髓区和白脾髓区,红脾髓区一般为血红细胞的集中区,而白脾髓区为淋巴细胞集中的区域,两者在脾脏组织中相嵌而成。患腹水症的半滑舌鳎脾脏红脾髓区的血红细胞着色加深 (图1-K),并呈现黄褐色,与溶血性贫血的病理特征极为相似[10]。而在淋巴细胞集中的白脾髓区可以发现大量已经空泡化的淋巴细胞存在 (图1-L)。超微病理观察发现,病变脾脏中红脾髓区的血红细胞大量死亡,细胞核固缩,细胞质逐渐崩解消失 (图1-M)。而发生空泡变性的淋巴细胞胞内细胞器也发生了崩解,整个细胞胞内结构已经杂乱无章,细胞质出现大面积的空泡区 (图1-N)。

图1 患腹水症的半滑舌鳎及其鳍部皮肤、鳃丝、肝胰脏和脾脏的病理变化Fig.1 The pathological changes in half-smooth tongue sole,its skin,gill,hepatopancreas,and spleen with ascites symptom

肾脏硬骨鱼的肾脏主要由肾小球、肾小管和填充其中的肾间质组织构成[10]。健康半滑舌鳎的肾间质组织致密,肾小球和肾小管结构完整清晰,排列有序。患腹水症病鱼的肾脏病变主要表现为肾间质组织局灶性的大面积坏死和崩解,肾间质组织几乎完全消失 (图2-A),在坏死的组织间发现血红细胞局部淤积和H.E染色呈深紫色的病毒包涵体存在 (图2-B)。超微病理观察发现,坏死区的肾间质细胞中充满了大量的病毒粒子,原有的细胞质和细胞器已经完全消失 (图2-C)。待病毒粒子完全释放后,整个肾间质细胞同病变的肝细胞一样呈现出空泡样的环状结构 (图2-D)。

心脏患腹水症的半滑舌鳎心脏部分心肌纤维发生了固缩,心肌纤维之间出现了明显的空白区域(图2-E)。病变严重时,心肌出现了局灶性的组织溃烂,致使原有的心肌三维空间网状结构被完全破坏,坏死的心肌组织间也发现大量H.E染色呈紫色的炎症细胞浸润 (图2-F)。

胆囊患腹水症的半滑舌鳎胆囊壁主要有两种明显的病理变化:一是平滑肌层的毛细血管扩张充血,严重时大量血红细胞淤积于毛细血管管腔内形成血栓 (图2-G);二是胆囊壁浆膜层发生非常明显的局灶性结缔组织增生,使浆膜层局部组织加厚(图2-H)。

消化道患腹水症的半滑舌鳎消化道病变明显的临床特征是消化道壁变得薄而透明。组织病理观察发现,病鱼消化道的黏膜层和黏膜固有层发生组织分离,黏膜固有层或出现组织固缩,或组织中成纤维细胞发生水样变性,使整个固有层呈水肿状态(图2-I)。而致密层组织也变得非常疏松,呈现多孔样,部分区域出现轻微的溃烂 (图2-J)。超微病理观察发现,黏膜固有层成纤维细胞病变初期细胞质中出现大量空泡,随后空泡相互连结成大片的空白区,细胞质基本消失 (图2-K)。至后期在黏膜固有层中形成了大量空泡区,并逐步造成黏膜层和黏膜固有层解离 (图2-L)。

3 讨论

腹水症是多种海、淡水经济鱼类人工养殖过程中最易发生的疾病之一,它以鱼体腹腔或消化道腔内形成大量无色或黄色积水为主要临床特征,具有极高的感染率和死亡率,能造成严重的经济损失,已经成为鱼类集约化养殖生产中的普遍性问题。

从临床症状上看,感染腹水症的不同鱼类大多表现出活力下降、摄食减弱、腹部隆起以及内脏器官出现不同程度的充血、肿大、发炎等特征。本研究中感染腹水症的半滑舌鳎病鱼也表现出与之相似的外观病变特征。不同的是,笔者所解剖的半滑舌鳎病鱼腹水大多集中于消化道腔内。病变严重时,由于消化道腹水积压过多,对腹腔压力增大,因而导致部分消化道胀出泄殖孔,形成更为明显的临床病灶,在生产实践中更容易识别。

对于养殖鱼类腹水症的发生原因,国内外学者已进行了广泛研究。多数学者研究认为,生物性病原的感染是诱发鱼类腹水症的主要原因,其中以细菌感染最为多见。李筠等[11]报道了迟钝爱德华氏菌可以造成养殖大菱鲆的腹水症,张伟妮等[12]从患腹水症的大菱鲆中分离出溶藻弧菌,莫照兰等[13]从患腹水症的牙鲆幼鱼体内分离出灿烂弧菌,王国良等[14]报道了拟态弧菌可造成黑鲷幼鱼的腹水症,Altinok等[15]报道了假单胞菌感染的虹鳟鱼也出现了腹水症状。本研究中,通过超微病理观察,在出现腹水症状的半滑舌鳎肾脏和肝脏组织中都发现了病毒粒子存在,其中肾脏中病毒粒子数量尤其巨大,这也直接证实了半滑舌鳎腹水症很有可能是由病毒引起的。

有关鱼类腹水症组织病理学方面的研究报道相对较少。张涛等[16]对患腹水症的黄颡鱼进行了组织病理学研究,结果显示病鱼的鳃小叶上皮细胞出现肿胀、增生和肥大等病理变化,这与笔者观察到半滑舌鳎病鱼鳃小叶上皮细胞水肿和柱状细胞发生炎症且鳃小叶似组织增生状极为相似。患腹水症的黄颡鱼组织器官病变还表现在肾小管和肾间质的组织坏死,肾小球正常结构消失,肝细胞水泡变性和肝组织局灶性坏死[16]。古丽加玛·买买提等[17]对患腹水症的罗非鱼进行了组织病理学研究,结果发现病鱼的各个组织器官也都发生了不同程度的病变,其中肝脏、肾脏和脾脏的病变最为明显,出现了组织坏死、充血和炎性细胞浸润等严重的病理变化。与以上两位学者的研究结果相比,患腹水症的半滑舌鳎肝胰脏和肾脏都出现了局灶性的大面积组织坏死和溃烂,大量的肝细胞和肾间质细胞都发生了空泡变性,病理变化表现得更为严重。Teruo等[18]对迟钝爱德华氏菌感染牙鲆导致的腹水症也进行了组织病理学研究,结果发现,病鱼牙鲆的肝脏和肾脏中出现了组织脓肿,在部分病鱼的心脏、鳃小叶和肌肉中也出现了脓肿,并推测这些脓肿的形成大多是因为病原细菌入侵造成的。而这一病理现象在本研究中并没有发现。

与上述研究结果不同的是,本研究中观察到感染腹水症的半滑舌鳎心脏出现诸如心肌固缩和局灶性溃烂等比较严重的病变。心脏是鱼类重要的循环器官,其严重的病变势必会造成机能下降。通过病理学观察,在病鱼的皮肤、肝胰脏、肾脏等组织器官中都发现了明显的血红细胞浸润或淤积现象,而脾脏中血红细胞也出现了大量死亡。从这些病理现象分析,由于病鱼血细胞的大量流失和心脏组织的病变,患腹水症的半滑舌鳎一定存在着比较严重的机体循环障碍。

图2 患腹水症的半滑舌鳎肾脏、心脏、胆囊和消化道的病理变化Fig.2 The pathological changes of kidney,heart,gallbladder,and digestive tract in half-smooth tongue sole with ascites symptom

此外,患腹水症的半滑舌鳎消化道的病变也是非常明显的。主要的病理变化包括黏膜层和黏膜固有层发生组织固缩和分离,黏膜固有层成纤维细胞水样变性,局灶性组织溃烂等。消化道是鱼类汲取外界营养最主要的器官,健康鱼通过消化道黏膜层吸收营养物质,经黏膜固有层的毛细血管转运输送至全身各个器官。而患腹水症的半滑舌鳎病鱼消化道出现这些病变,足以造成鱼体吸收障碍,使其正常的新陈代谢受到影响。这也有可能是造成腹水症病鱼不摄食或摄食力减弱的主要原因。

从组织病理学研究结果推测,半滑舌鳎的腹水症极有可能是由病毒感染引起的,而病毒的主要侵染器官是肾脏和肝脏,在其他组织器官中并没有发现病毒粒子。然而,病鱼全身多个组织器官都出现了不同程度的病变,这必然会导致多器官功能的衰竭,形成循环和吸收障碍,进而使鱼体逐渐丧失正常的生理代谢,最终造成病鱼死亡。养殖生产中对于该病应该以提前预防为主,经常观察养殖池中鱼的生理状态变化,分捡活力较弱或摄食不佳的病鱼,并及时采取有效的消毒措施和投喂一些能够增强机体免疫力的中草药[19],以降低该病的发生机率。

[1]雷霁霖.海水鱼类养殖理论与技术[M].北京:中国农业出版社,2005.

[2]柳学周,庄志猛,马爱军,等.半滑舌鳎繁殖生物学及繁育技术研究[J].海洋水产研究,2005,26(5):7-14.

[3]孙中之,柳学周,徐永江,等.半滑舌鳎工厂化人工育苗工艺技术研究[J].中国水产科学,2007,14(2):244-248.

[4]蔡文超,柳学周,马学坤,等.半滑舌鳎早期发育阶段鳔和冠状幼鳍的生长发育规律研究[J].海洋水产研究,2006,27(2): 94-98.

[5]王新安,马爱军,庄志猛,等.半滑舌鳎Cynoglossus sem ilaevis摄食行为感觉作用的研究[J].海洋与湖沼,2006,37(6):555-560.

[6]梁友,柳学周.半滑舌鳎室内水泥池和池塘养殖技术的初步研究[J].海洋水产研究,2006,27(2):69-73.

[7]张晓君,秦国民,阎斌伦,等.半滑舌鳎病原鳗利斯顿氏菌表型及分子特征研究[J].海洋学报,2009,31(5):112-122.

[8]Wang Yan,Han Yin,Li Yun,et al.Isolation of Photobacterium damselae subsp.piscicida from diseased tongue sole Cynoglossus semilaevis Günther in China[J].Acta Microbiologica Sinica,2007, 47(5):763-768.

[9]Tang X Q,Zhou L,Zhan W B,et al.Isolation and characterization of pathogenic Listonella anguillarum of diseased half-smooth tongue sole Cynoglossus semilaevis Günther[J].Journal of Ocean University of China,2008,7(3):343-351.

[10]宋振荣.水产动物病理学[M].厦门:厦门大学出版社,2009.

[11]李筠,颜显辉,陈吉祥,等.养殖大菱鲆腹水病病原的研究[J].中国海洋大学学报,2006,36(4):649-654.

[12]张伟妮,周丽,邢婧,等.养殖大菱鲆腹水症病原菌SR1的分离及鉴定[J].中国水产科学,2006,13(4):603-609.

[13]莫照兰,茅云翔,陈师勇,等.养殖牙鲆鱼苗腹水症病原菌的鉴定及系统发育学分析[J].海洋与湖沼,2003,34(2):131-141.

[14]王国良,郑天伦,金珊,等.黑鲷幼鱼腹水病病原菌[J].中国兽医学报,2003,23(1):33-35.

[15]Altinok I,Balta F,Capkin E,et al.Disease of rainbow trout caused by Pseudomonas luteola[J].Aquaculture,2007,273:393-397.

[16]张涛,宋文华,于翔,等.黄颡鱼腹水病的组织病理研究[J].水产学杂志,2009,22(2):29-33.

[17]古丽加玛·买买提,汪博良,秦莉,等.罗非鱼“腹水病”组织病理学研究[J].新疆农业科学,2011,48(10):1923-1928.

[18]Teruo M,Noboru K.Comparative histopathology of edwardsiellosis in fishes[J].Fish Pathology,1985,20(2/3):219-227.

[19]吴亚楠,柳鹏,李强,等.复方中草药对仿刺参免疫力和抗病力的影响[J].大连海洋大学学报,2011,26(4):338-343.

Histopathology of half-smooth tongue sole Cynoglossus semilaevis Günther with viral ascites

ZHANG Zheng,RONG Xiao-jun,WANG Yin-geng,WANG Lan,LIAO Mei-jie,LI Bin

(Yellow Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Qingdao 266071,China)

The histopathology of half-smooth tongue sole Cynoglossus semilaevis Günther with viral ascites was studied using paraffin section technique and transmission electron microscopy in order to find out the pathological changes in tissues and organs.The results showed that various lesions were found in most organs of the diseased fish.In comparison with healthy fish,the diseased fish showed the major pathological changes in tissues and organs,including erythrocyte infiltration and accumulation in skin tissues of fin,epithelial cell vacuolar degeneration and pillar cells inflammation of gill filament;focal tissues necrosis and ulcer full of numerous vacuolar degeneration cells in the hepatopancreas and kidney;massive virions occurred in the hepatopancreas and kidney;myocardium tissues pyknosis and focal ulceration in heart;connective tissue of serous membrane hyperplasia and capillaries extensive congestion in gall bladder walls.Lamina propria dissociated from mucosal epithelia,stratum compactum appeared porosity and fibroblasts of lamina propria were hydropic degeneration or pyknosis in the digestive tract.

Cynoglossus semilaevis Günther;fish disease;ascites;virus;histopathology

S941.41

A

2012-09-13

国家科技支撑计划项目 (2012BAD17B03)

张正 (1979-),男,博士,副研究员。E-mail:zhangzheng@ysfri.ac.cn

王印庚 (1963-),男,博士,研究员。E-mail:wangyg@ysfri.ac.cn

2095-1388(2013)03-0287-06