“光合1号”中华绒螯蟹微卫星富集文库的构建与多态性标记的筛选

田盛君,李晓东,姜玉声,刘胥,杨红威,原振政,郑岩

(1.大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室,辽宁大连116023;2.盘锦光合蟹业有限公司研发中心,辽宁盘锦124000)

“光合1号”中华绒螯蟹微卫星富集文库的构建与多态性标记的筛选

田盛君1、2,李晓东2,姜玉声1,刘胥2,杨红威1、2,原振政2,郑岩2

(1.大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室,辽宁大连116023;2.盘锦光合蟹业有限公司研发中心,辽宁盘锦124000)

采用磁珠富集法 (Fast isolation by AFLP sequences containing repeats,FIASCO)构建 “光合1号”新品种中华绒螯蟹Eriocheir sinensis基因组微卫星文库。用PCR法对225个单菌落进行鉴定,共获得168个阳性克隆,测序发现有94个含有微卫星座位,其准确率为55.95%,其中单元重复次数为5～10的序列占34.04%,重复次数为10～20的序列占20.21%,重复次数大于20的序列占45.75%,重复次数最高达到92次;完美型微卫星座位69个 (占73.40%),非完美型微卫星座位17个 (占18.09%),混合型微卫星座位8个 (占8.51%);根据微卫星侧翼序列设计并合成53对引物,检测结果显示,有31对 (占58.50%)引物能够扩增出特异性条带;选择其中14对多态性良好的引物用于中华绒螯蟹辽河野生群体的遗传多样性分析,共检测到148个等位基因,单个位点等位基因数为7～13个,平均为10.6个,观测杂合度为0.214 3～0.666 7,期望杂合度为0.825 4～0.910 1,多态性信息含量为0.766 3～0.865 4。

中华绒螯蟹;微卫星文库;分子标记;遗传分析

中华绒螯蟹Eriocheir sinensis又名河蟹、大闸蟹,隶属于十足目、方蟹科、绒螯蟹属,为中国重要的经济蟹类[1]。随着大规模养殖业的发展,中华绒螯蟹种质退化现象明显,遗传改良及良种培育工作已引起关注[2]。盘锦光合蟹业有限公司于2000年开始中华绒螯蟹 “光合1号”良种选育工作,2011年通过了国家级良种审定委员会审定,并由农业部发布了建议在全国推广养殖的新品种公告。水产动物新品种选育需要准确的亲缘关系鉴定及遗传分析技术[3]。由于蟹类具有蜕壳习性,通常的体外物理标记很难应用于实际工作,借助现代分子标记技术是解决此类问题的有效途径之一。作为第二代分子标记技术的微卫星,具有符合孟德尔分离定律、多态性信息含量丰富、呈共显性遗传等特点,已应用于蟹类的遗传分析[4-7]。迄今,在GenBank公布的中华绒螯蟹微卫星座位有123个,而能够稳定扩增、多态性良好的引物不超过70对[8-13]。相对于其他经济鱼类,中华绒螯蟹可用于标记的数量太少,势必阻碍分子辅助育种技术的研究与应用。本研究中,作者采用磁珠富集法 (Fast isolation by AFLP sequences containing repeats,FIASCO)[14]构建中华绒螯蟹 “光合1号”的微卫星文库,并筛选多态性微卫星标记,旨在丰富中华绒螯蟹分子标记数量,同时也为寻找 “光合1号”中华绒螯蟹特异标记奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

选择盘锦光合蟹业有限公司选育的 “光合1号”新品种中华绒螯蟹构建微卫星文库。选用辽河水系野生中华绒螯蟹35只用于多态性微卫星标记的筛选。

磁珠为链霉亲和素包被的磁珠 (Promega公司),MseI内切酶 (NEB公司),生物素标记探针为(GT)13-biotin(Invitrogen公司)。MseI人工接头序列为Oligo-MseIA 5＇-TACTCAGGACTCAT-3＇、Oligo-MseIB 5＇-GAGTCCTGAGTAGCAG-3＇、MseI-N引物5＇-ATGAGTCCTGAGTAA(N)-3＇,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的制备及目的片段的获取 取试验蟹步足肌肉于-80℃下保存待用。采用改进的SDS-CTAB法提取 DNA[15],调整其浓度为100 ng/μL。基因组DNA经MseI酶切,与MseIA/MseIB接头连接,用MseI-N引物进行预扩增。PCR扩增产物经15 g/L琼脂糖电泳检测后,用凝胶回收试剂盒 (Tiangen公司)回收长度为250～1 000 bp的DNA片段。

1.2.2 磁珠富集微卫星DNA片段 取上述回收产物,加入杂交液和生物素标记探针 (GT)13,于94℃下变性5 min,65℃下反应30 min,缓慢冷却至室温,10℃下保存备用。用1 mL TEN100试剂洗涤链霉亲和素包被的磁珠 (Promega公司)3次,将清洗好的磁珠溶于40 μL TEN100中,加入杂交产物,室温下放置30 min。将悬浮均匀的磁珠液放置于磁力架上固定,移去杂交液,用洗脱液TEN1000洗涤3次。再加入400 μL洗脱液 (0.2× SSC+0.1%SDS)洗涤磁珠3次。向磁珠中加入TE buffer,重悬磁珠。于95℃下变性5 min,待含有微卫星重复序列的单链DNA释放出后,迅速用磁力架固定磁珠,吸出TE buffer,将单链DNA于-20℃下保存备用。

1.2.3 回收DNA片段的PCR扩增及克隆测序

以上述单链DNA片断为模板,用MseI-N接头引物进行PCR扩增以获得双链目的片断。PCR反应体系共20 μL,包含10 μmol/L MseI-N引物1.0 μL,10×PCR buffer(Mg2+free) 2.0 μL,25 mmol/L MgCl21.2 μL,5 U/μL Taq DNA polymerase 0.2 μL,2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL,10×连接产物5.0 μL,用灭菌ddH2O补至20 μL。PCR反应条件为:94℃下预变性5 min;94℃下变性30 s,53℃下退火30 s,72℃延伸1 min,共进行35个循环;最后在72℃下延伸10 min。

采用PGM-T克隆试剂盒 (Tiangen公司)将纯化后的PCR产物连接到PGM-T载体中,取5 μL连接产物加入到50 μL TOP10(Tiangen公司)感受态细胞中进行转化,挑选单个菌落于LB液体培养基中振荡培养约6 h。用PCR方法对菌液进行阳性克隆鉴定,扩增产物用琼脂糖电泳检测,最后选取长度为250～1 000 bp的目的片段进行测序。

1.2.4 引物设计及多态性检测 利用SSR Hunter 1.3软件[16]辅以人工查寻含有微卫星重复序列的序列,将新的微卫星序列通过BankIt(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/genbank)在线提交到 GenBank数据库中(JX683665～JX683678)。根据各微卫星两侧翼序列用 Primer Premier 5.0软件设计引物,委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

通过梯度PCR法,筛选出各引物的最佳退火温度。最后以35只辽河野生群体中华绒螯蟹的基因组DNA为模板,进行多态性微卫星位点的检测。PCR反应体系共20 μL,包括10 mmol/L上、下游引物各 0.6 μL,10×PCR buffer(Mg2+free)1.5 μL,25 mmol/L MgCl20.9 μL,5 U/μL Taq DNA polymerase 0.1 μL,2.5 mmol/L dNTPs 1.2 μL, DNA 1 μL,最后用灭菌双蒸水补足至20 μL。PCR反应程序:94℃下预变性5 min;94℃下变性30 s,各退火温度下退火30 s,72℃下延伸1 min,共进行30个循环;最后在72℃下延伸10 min。扩增产物先用8%聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳进行分离,再进行银染检测,最后用凝胶成像仪拍照并保存。

1.3 数据处理

采用PBR322/MspI(Tiangen公司)估计等位基因的大小。利用PopGene 1.32软件[17]计算分析多态性微卫星位点的等位基因数 (Na)、观测杂合度 (Ho)、期望杂合度 (He),多态性信息含量(PIC)按下式计算[18]:

其中:Pi、Pj分别为群体中第i个和第j个等位基因的频率;n为等位基因数。

2 结果与分析

2.1 阳性克隆的鉴定及测序

采用PCR方法对平板中随机挑选的225个单菌落进行鉴定,获得168个阳性克隆,阳性克隆得率为74.67%。对阳性克隆进行测序共获得94个含有微卫星座位的克隆。采用PCR方法鉴定微卫星阳性克隆的准确率为55.95%,部分结果见图1。

2.2 序列分析

图1 用PCR方法鉴定阳性克隆Fig.1 PCR amplification for positive clone testing

对94个含有微卫星座位的序列进行分析,发现其中以GT/AC重复单元为主,也存在含有TC、TCA、AAGG、TGTA和CACG等重复单元的序列。重复次数为5～10的占34.04%,重复次数为10～ 20的占20.21%,重复次数大于20的占45.75%,重复次数最高达到92次。根据Weber等[19]提出的微卫星座位分类标准,所测序列中有完美型微卫星座位69个 (占73.40%),非完美型17个 (占18.09%),混合型8个 (占8.51%)。

2.3 微卫星引物筛选及其位点特征

含有微卫星座位的94个序列中,有41个因为侧翼序列太短或二级结构太多不能设计出高质量引物,最终设计并合成了53对微卫星引物。采用梯度PCR法优化PCR反应条件,检测结果显示有31对引物能够扩增出特异性条带。以35只辽河水系野生中华绒螯蟹的基因组DNA为模板进行多态性微卫星位点的验证,发现14对表现出良好的多态性 (表1),部分扩增结果见图2。

表1 “光合1号”中华绒螯蟹14个微卫星标记及其引物序列Tab.1 The 14 microsatellite markers and primer sequences from Chinese metten carb“Guanghe No.1”

图2 引物GH26在辽河水系中华绒螯蟹个体中的扩增Fig.2 Amplified alleles on GH26 locus in 35 individuals of Chinese metten carb Eriocheir sinensis from Liaohe River

14个微卫星位点上共检测得到148个等位基因,每个位点的平均Na为10.6个,多数位点为9～12个,最少为7个,最多为13个;各微卫星位点的Ho为0.214 3～0.666 7,平均为0.481 3, He为0.825 4～0.910 1,平均为0.871 4,PIC为0.773 9～0.865 4,平均为0.823 7(表2)。根据Botsein等[20]的分类方法,14个微卫星位点的PIC值均高于0.5,属高多态性位点。

表2 “光合1号”中华绒螯蟹14个微卫星标记的特征分析Tab.2 Characteristics of 14 microsatellite loci from Chinese mitten crab“Guanghe No.1”

3 讨论

构建基因组文库时结合杂交探针筛选和生物素标记探针 (磁珠富集)筛选,是获得微卫星标记的两个主要策略。然而,前者阳性克隆率较低,且获得的微卫星标记数较少[21];后者因为能有效地提高微卫星标记的筛选效率,已被广泛应用于水产动物分子标记的分离[3]。本试验中采用FIASCO磁珠富集法构建微卫星文库[14],该方法基于AFLP技术,其消化和连接反应同时进行,特殊的接头引物设计,解决了其他类似方法中因个别扩增产物大量富集,导致的微卫星序列得率低的问题。与以往使用的磁珠富集法相比,FIASCO法具有操作简单、微卫星获得效率高、不使用放射性同位素、安全环保等优点。

构建文库后,通常要对文库中阳性克隆进行二次筛选,以保证微卫星序列的得率[3,21]。毛瑞鑫等[22]采用同位素杂交对中华绒螯蟹磁珠富集微卫星文库进行二次筛选,得到阳性克隆447个 (阳性克隆率约为29.8%),经测序发现有248个 (占55.5%)含有微卫星序列的克隆。宋春妮等[23]采用磁珠富集方法构建了日本蟳微卫星文库,并用PCR方法由970个菌落中筛选获得了369个阳性克隆 (阳性克隆率约为38.0%),其中有321个 (占86.99%)含有微卫星序列。本试验中,采用PCR方法在225个单菌落中筛选获得了168个阳性克隆,经测序发现有94个 (占55.9%)含有微卫星序列,表明PCR方法能够高效地筛选阳性克隆,且相对于同位素杂交要更为安全、简便。

在鱼类、虾蟹类等生物基因组中均存在两碱基重复类型的微卫星序列[24]。本试验中选用 (GT)13生物素标记探针构建文库,结果大部分微卫星序列与探针序列相符,只是重复次数有所不同。另外,还发现部分二碱基 (TC)、三碱基 (TCA)和四碱基 (CACG、TGTA)重复单元。人类基因组中三、四碱基为重复单元的微卫星序列,呈现丰富的多态性,具有明显的等位基因差异以及 “影子带”少的特点[24-25]。 李文升等[26]分别以 (AGAT)6和(CGA)8为探针获得了草鱼相应的微卫星标记,证实了三碱基或四碱基为重复单元的微卫星多态性明显高于二碱基重复单元的微卫星。

Weber[27]认为,二碱基重复序列重复次数大于12,微卫星标记才有可能表现出较高的PIC,当重复次数超过16时,PIC值则大于0.5。草鱼三碱基和四碱基重复序列的重复数大于5时,在个体间即表现出不同程度的多态性[26]。本研究中10个含二碱基重复序列的位点在中华绒螯蟹辽河野生群体中的PIC值均大于0.5,除GH28外,其余的重复单元的重复数大于或等于16;而三碱基和四碱基重复序列的重复数等于5时,标记的PIC值已超过0.5,与上述报道相似。中华绒螯蟹以3个或3个以上碱基为重复单元的微卫星标记是否会包含更多的遗传信息,进而提供更高效的分子标记,将是进一步研究的问题。

本研究中获得的14个多态性微卫星位点的PIC为0.766 3～0.865 4,这些位点均为高多态性位点,能够应用于中华绒螯蟹亲缘关系的鉴定及遗传分析。人工选育通常会导致近交几率的增加,群体中则表现为遗传变异程度和遗传多样性指数的降低[28]。 “光合1号” 中华绒螯蟹经过多代人工选育,其遗传多样性可能已发生改变,因而会出现一些特殊的分子标记。本试验中所筛选的微卫星标记是否具有群体特异性,将有待进一步研究。

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Microsatellite-enriched library construction and polymorphic microsatellite marker isolation in Chinese mitten crab Eriocheir sinensis strain“Guanghe No.1”

TIAN Sheng-jun1,2,LI Xiao-dong2,JIANG Yu-sheng1,LIU Xu2, YANG Hong-wei1,2,YUAN Zhen-zheng2,ZHENG Yan2
(1.Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023, China;2.Research&Development Center,Panjin Guanghe Crab Industry Co.Ltd.,Panjin 124000,China)

A microsatellite-enriched genomic library for selective breeding population of Chinese mitten crab Eriocheir sinensis“Guanghe No.1”,was constructed using FIASCO(Fast isolation by AFLP sequences containing repeats)method.One hundred and sixty-eight positive clones were obtained from 225 randomly picked colonies with PCR method,in which 94(55.95%)containing microsatellite sequence after sequence analysis,the unit number of repetitions in the 5-10 sequence accounted for 34.04%,10-20 accounted for 20.21%,greater than 20 accounted for 45.75%,the maximum number of repetitions of 92 times;73.40%were perfect,18.09%were imperfect and 8.51%turned out to be compound.Fifty-three pairs of primers designed and synthesized based on microsatellite flanking sequences showed that 31 pairs(58.50%)primers were amplified for specific bands.The selected 14 polymorphism good primer were used to analyze the genetic diversity of the Liaohe wild populations,148 alleles were detected,the number of single locus alleles 7-13,with an average of 10.6,and the observed heterozygosity per locus were varied from 0.214 3 to 0.666 7,and the expected heterozygosity from 0.825 4 to 0.910 1.PIC(Polymorphic information content)per locus was found to be from 0.766 3 to 0.865 4.

Eriocheir sinensis;microsatellite library;molecular marker;genetic analysis

S917.4

A

2012-11-01

国家 “863”计划项目 (2012AA10A400);“十二五”农村领域国家科技计划项目 (2012AA10A400)

田盛君 (1986-),男,硕士研究生。E-mail:tiansj@yeah.net

李晓东 (1965-),男,教授级高级工程师。E-mail:lxd001@ceraap.com

2095-1388(2013)03-0230-06